Khảo sát sự biến đổi gen nat2 và gstp1 mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic nam giới vô sinh

Nội dung text: Khảo sát sự biến đổi gen nat2 và gstp1 mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic nam giới vô sinh

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI GEN NAT2 VÀ GSTP1 MÃ HÓA ENZYM CHUYỂN HÓA XENOBIOTIC NAM GIỚI VÔ SINH Vũ Thị Huyền*; Nguyễn Thị Trang*; Uông Ngọc Nguyên*; Trần Đức Ph n* TÓM TẮT Mục tiêu: khảo sát đột biến GSTP1 (313G>A (I105V), NAT2 (481C>T (L161L) liên quan gây vô sinh (VS) nam. Đối tượng và phương pháp:ADN của 200 đối tượng nghiên cứu (100 nam giới VS và 100 người bình thường) được nhân lên và xác định đột biến gen bằng kỹ thuật ARMS - PCR. Kết quả: các kiểu gen CT và TT của gen NAT2 (481C>T), (OR 3,12; 95%CI: 1,72 - 5,68, p < 0,001) và GA + AAcủa gen GSTP1(G313A) (OR 5,25; 95%CI: 2,71 - 10,19, p < 0,001) có nguy cơ cao gây VS nam. Kết luận: nghiên cứu thí điểm này cho thấy các đa hình GSTP1 (G313A) vàNAT2 (481C>T) là dấu hiệu di truyền mới liên quan với stress oxy hóa và tình trạng VS nguyên phát. * Từ khóa: GSTP1; NAT2; Xenobiotic; Vô sinh nam; Đột biến. Identification of Genetics Polymorphism of Xenobiotic Metabolic Enzymes NAT2 and GSTP1 in Infertile men by ARMS-PCR Method Summary Objectives: To investigate whether two common single-nucleotide polymorphisms (SNP) of the NAT2 gene (481C>T (L161L) and GSTP1 (313G>A (I105V)) were associated with susceptibility to male infertility. Subjects and methods: A total 200 DNA samples (100 infertile patients and 100 fertile men) were genotyped for the polymorphisms by ARMS - PCR. Results: There was a significant association between the NAT2 variant genotypes (CT + TT (481C>T), (OR 3.12; 95%CI: 1.72 - 5.68, p< 0.001) and or NAT2 variant genotypes GSTP1 (G313A), (OR 2.95; 95%CI: 1.51 - 5.79, p < 0.001) with idiopathic infertility risk. Conclusions: This pilot study found that the polymorphisms GSTP1 (481C>T) and NAT2 (590G>A) were some novel genetic markers for susceptibility to idiopathic male infertility, but the risk is potentiated by exposure to various environmental oxidants. * Keyworks: GSTP1; NAT2; Xenobiotic; Infertile men; Mutation. ĐẶT VẤN ĐỀ toàn thế giới. Một trong những nguyên Vô sinh nói chung và VS nam giới nhân gây VS mà hiện nay đang được nói riêng là một vấn đề sức khỏe sinh đề cập nhiều đó là sự mất cân bằng sản, gây ảnh hưởng lớn tới chất lượng trong chuyển hóa các chất của cơ thể, cuộc sống của nhiều cặp vợ chồng trên trong đó có chuyển hóa xenobiotic. * Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Vũ Thị Huyền (drhuyenvu@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 29/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 05/09/2017 292
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Xenobiotic là chất hóa học lạ đối với Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng cơ thể, bao gồm các chất được đưa vào của đột biến gen NAT2 và gen GSTP1 đối cơ thể hàng ngày như thuốc, rượu, thuốc với VS ở nam giới được tiến hành ở lá, mỹ phẩm, chất bảo quản, thuốc bảo vệ nhiều quốc gia. Tuy nhiên, tại Việt Nam thực vật...Khi quá trình chuyển hóa chưa có nghiên cứu nào đánh giá sự ảnh xenobiotic ở trạng thái cân bằng sẽ giúp hưởng của những gen này. Mục tiêu cơ thể đào thải, khử độc và tránh được nghiên cứu:Mô tả tỷ lệ xuất hiện một số đột biến gen NAT2 và GSTP1 ở nam giới tác động không tốt của xenobiotic đối với VS nguyên phát. Bước đầu xác định mối cơ thể [1 . Khi quá trình chuyển hóa liên quan giữa một số đột biến gen NAT2 xenobiotic bị rối loạn, xuất hiện tình trạng và GSTP1 với VS nam. tích tụ các xenobiotic và sản phẩm chuyển hóa của chúng trong cơ thể, bao ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP gồm các gốc tự do không có lợi. Đó là NGHIÊN CỨU nguyên nhân gây ra nhiều bệnh, trong đó 1. Đối tƣợng nghiên cứu. có VS [2]. Bệnh nhân nam VS không rõ nguyên Trong quá trình chuyển hóa xenobiotic, nhân trong độ tuổi sinh sản (20 - 50) đã NAT2 và GSTP1 là các gen có vai trò làm xét nghiệm tinh dịch đồ tại Trung tâm quan trọng trong việc mã hóa enzym liên Tư vấn - Di truyền, Đại học Y Hà Nội từ quan đến biến đổi xenobitic ở giai đoạn II, 2015-2017. biến đổi thành chất dễ thải trừ ra môi * Tiêu chuẩn lựa chọn: trường. Gen GSTP1 nằm trên NST - Nhóm bệnh: 100 nam giới VS không 11q13.3 và có một số alen phổ biến như có tinh trùng hoặc ít tinh trùng (< 15 triệu, GSTP1*A, GSTP1*B, GSTP1*C, GSTP1*D. WHO 2010). Thay thế G thành A tại vị trí 313 của exon - Nhóm chứng: 100 nam giới khỏe 5 dẫn đến làm thay thế axít amin isoleucin mạnh, có ít nhất 1 con. thành valin tại vị trí 105. Đột biến điểm * Tiêu chuẩn loại trừ: nam giới VS đã trên exon 5 này ảnh hưởng mạnh mẽ đến được chẩn đoán xác định nguyên nhân: hiệu quả của enzym GSTP1[3 . Gen viêm cơ quan sinh dục, giãn tĩnh mạch Arylamine N-acetyltransferase 2 (NAT2) tinh, tắc nghẽn đường sinh dục, mất đoạn nằm trên NST số 8 (8p22), là gen mã hóa nhỏ trên nhiễm sắc thể Y, nhiễm sắc đồ enzym NAT2 của giai đoạn II chuyển hóa bất thường, nội tiết tố bất thường, bị các xenobiotics có vai trò giải độc một số hóa bệnh ung thư, cấp tính, tâm thần chất như arylamine, hydrazines, các amin 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. thơm và dạng dị vòng để tạo thành các Tách chiết mẫu ADN từ máu ngoại vi chất trung gian thông qua phản ứng của (chống đông EDTA) bằng kit tách ADN N-acetyl hóa và O-acetyl hóa. Khi bị đột Express (Lytech, Nga). Sử dụng kỹ thuật biến sẽ dẫn đến rối loạn chức năng ARMS-PCR để xác định đa hình gen enzym giải độc, dẫn đến ung thư hoặc VS GSTP1 (313G>A (I105V), NAT2 (481C>T ở nam giới [4 . (L161L) với trình tự mồi: 293
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 Bảng 1: Trình tự mồi để khuếch đại 2 gen. Gen Polymorphism Tr nh tự mồi (313G>A (I105V) F: 5'- TGGGAGGGATGAGAGTAGGA -3' GSTP1 (exon 5) R: 5'- CAGGGTCTCAAAAGGCTTCAGT-3' 481 С/Т F: 5'-GCTGGGTCTGGAAGCTCCTC-3' NAT2 L161L R: 5'-TTGGGTGATACATACACAAG-3' (exon 2) Kỹ thuật ARMS - PCR thực hiện với thạch agarose 3% để xác định kiểu gen thể tích 50 μl phản ứng có chứa 5µl (50- của đối tượng nghiên cứu. 100 ng) ADN di truyền, trong mỗi ống * Xử lý số liệu:số liệu được thu thập và (allen bình thườnghoặc allen đột biến) xử lý trên phần mềm SPSS 16.0. 17,5 µl đệm PCR, 2,5 µl primer mix (mồi * Đạo đức nghiên cứu: BN hoàn toàn bình thường hoặc mồi đột biến), 0,2 Taq tự nguyện tham gia vào nghiên cứu và có ADN polymerase và 25 µl dầu khoáng quyền rút khỏi nghiên cứu khi không đồng (Lytech, Nga) với chu trình luân nhiệt: ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Bệnh 930C/1 phút; 35 chu kì (93oC/10s, nhân sẽ được thông báo về kết quả xét 64oC/10s, 72oC/20s), 72oC/10 phút. Sản nghiệm gen. Các thông tin cá nhân được phẩm PCR sau đó được điện di trên đảm bảo bí mật. KÊT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Ph n bố tuổi của nhóm nghiên cứu. Bảng 2: Phân bố nhóm tuổi của nhóm bệnh và nhóm chứng. Nhóm chứng Nhóm bệnh p Tuổi % n % 20 - 29 40 40,0 27 27,0 30 - 39 42 42,0 53 53,0 p > 0,05 40 - 49 15 15,0 20 20,0 50 - 59 3 3,0 0 0 X ± SD 31,88 ± 6,33 33,95 ± 7,19 > 0,05 Ở cả hai nhóm bệnh và nhóm chứng, nam giới trong độ tuổi 30 - 39 chiếm tỷ lệ cao nhất. Độ tuổi chiếm tỷ lệ thấp nhất 50 - 59 tuổi. Tỷ lệ phân bố nhóm tuổi ở cả 2 nhóm bệnh và chứng không có sự khác biệt. 294
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 2. Đặc điểm nội tiết tố ở nhóm nam giới VS. Bảng 3: Đặc điểm nội tiết của nhóm bệnh và nhóm chứng. X ± SD (IU/L) Nhóm n FSH LH Testosteron Nhóm bệnh 100 17,34 ± 3,27 16,33 ± 2,53 13,02 ± 1,62 Nhóm chứng 100 11,62 ± 12,60 6,56 ± 4,19 15,86 ± 5,50 Giới hạn bình thường 5 - 20 5 - 20 10 - 35 Giá trị trung bình FSH, LH và testosterone của BN nhóm bệnh và nhóm chứng trong giới hạn bình thường. 3. Kết quả ph n tích đ t biến gen NAT2 C481T ở nhóm bệnh và nhóm chứng. Bảng 4: Kết quả phân tích gen đột biến gen NAT2 C481T. NAT2 Nhóm bệnh Nhóm chứng 481C>T (n = 100) (n = 100) Chi-squared OR 95%CI CC 49 (49%) 75 (75%) 0,32 0,18 - 0,58 CT 51 (51%) 25 (25%) 14,35 p < 0,001 3,12 1,72 - 5,68 TT 0 (0%) 0 (0%) 1,0 0,02 - 50,89 CT+TT 51 (51%) 25 (25%) 3,12 1.72 - 5.68 Tỷ lệ mang người mang kiểu gen CT ở nhóm bệnh là 51%, nhóm chứng là 25%. Không gặp trường hợp nào mang gen TT ở cả hai nhóm. Trường hợp CT+TT gặp ở nhóm bệnh và nhóm chứng lần lượt là 51% và 25% và có nguy cơ cao gây VS nam (OR = 3,12; CI = 1,72 - 5,68). 4. Kết quả ph n tích đ t biến gen GSTP1G313A ở nhóm bệnh và nhóm chứng. Bảng 5: Kết quả phân tích gen đột biến gen GSTP1 G313A. GSTP1 Nhóm bệnh Nhóm chứng Chi-squared OR 95%CI G313A (n = 100) (n = 100) GG 50 (50%) 84 (84%) 0,19 0,10 -0,7 GA 36 (36%) 16(16%) 30,32 2,95 1,1 - 5,79 AA 14 (14%) 0 (0%) p < 0,001 33,69 1,8 -573,6 26,14 GA+AA 50 (50%) 16 (16%) 5,25 2,1 -10,9 p < 0,001 Tỷ lệ người mang kiểu gen GA ở nhóm bệnh là 36%, nhóm chứng 16%. 14% ở nhóm bệnh mang kiểu gen AA, không gặp trường hợp nào mang kiểu gen AA ở nhóm chứng. Kiểu gen GA+AA gặp ở nhóm bệnh và nhóm chứng lần lượt là 50% và 16% có nguy cơ cao gây VS nam với (OR = 5,25; CI = 2,71 - 10,19; p < 0,001). 295
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 BÀN LUẬN di truyền, trong đó có bất thường về gen. Nghiên cứu cho thấy: ở nhóm chứng Do đó, ảnh hưởng tới chức năng sản xuất tinh trùng ở ống sinh tinh, trong khi nam giới VS, tuổi thấp nhất 22, tuổi cao đó hoạt động sản xuất hormon FSH và nhất 50, độ tuổi trung bình 31,88 ± 6,33. Trong đó, nhóm tuổi 30 - 39 chiếm tỷ lệ LH ở tuyến yên, testosteron ở tế bào Leyding vẫn bình thường. Giả thiết này cao nhất (42%). Ở nhóm bệnh, người có phù hợp với mục đích nghiên cứu của độ tuổi thấp nhất 22, cao nhất 49, độ tuổi trung bình 33,95 ± 7,19. Độ tuổi trung chúng tôi. Mặt khác, đối tượng nghiên cứu trong nhóm bệnh của chúng tôi là bình của 2 nhóm không khác biệt về ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, độ những nam giới VS nguyên phát, đã được loại trừ nguyên nhân: viêm cơ quan tuổi trung bình ở nhóm nghiên cứu của sinh dục, giãn tĩnh mạch tinh, tắc nghẽn chúng tôi cao hơn một chút so với nghiên cứu của tác giả Yufeng Quin (2013) tại đường sinh dục, mất đoạn nhỏ trên NST Y, nhiễm sắc đồ bất thường, nội tiết tố bất Trung Quốc (28,41 ± 4,61)[5] và thấp hơn so với các nghiên cứu ở các nước ở thường... Như vậy, kết quả trên thể hiện các BN trong nhóm bệnh phù hợp với tiêu phương Tây (Sonia Brahem (2011): chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu của 37,65) [6]. Điều này có thể do độ tuổi kết hôn ở Việt Nam thấp hơn so với các chúng tôi. nước phương Tây, việc quan tâm đến Đánh giá đột biến gen NAT2 (C481T) sức khỏe người dân đãtốt hơn trước. Vì ở nhóm bệnh với kiểu gen dị hợp tử CT vậy, họ đi khám sớm hơn. Ở phương (51%) cao hơn ở nhóm chứng (25%) cho Tây, nam giới lập gia đình muộn hơn so thấy nguy cơ VS tăng đáng kể ở những với Việt Nam, do đó nam giới đi khám và người mang kiểu gen này OR = 3,12; CI = điều trị VS cũng muộn hơn. 1,72 - 5,68, sự khác biệt có ý nghĩa thống Trong 100 BN trong nhóm bệnh và kê với p < 0,001. Không gặp trường hợp nhóm chứng được làm xét nghiệm nội tiết nào mang kiểu gen đồng hợp tử (TT) ở tố. Kết quả cho thấy: nồng độ FSH huyết cả hai nhóm. Nghiên cứu của Yarosh và thanh (17,34 ± 3,27 IU/L) và (11,62 ± CS (2014) [9] trên 203 BN VS nam và 227 12,60 IU/L), LH huyết thanh (16,33 ± 2,53 nam giới bình thường cho kết quả: Ở IU/L) và (6,56 ± 4,19 IU/L),testosterone nhóm bệnh có 46,8% trường hợp dị hợp huyếtthanh (17,02 ± 5,23 IU/L) và (15,86 tử, 34,5% bình thường, 18,7% đồng hợp ± 5,50 IU/L) trong giới hạn bình thường. tử đột biến. Ở nhóm chứng: 51,5% Nghiên cứu của chúng tôi tương đối phù trường hợp dị hợp tử, 34,8% bình thường hợp với các tác giả Ngô Xuân Bái (2010) và 14,1% đồng hợp tử đột biến. Kết quả [7 , Shalender Bhashin (2007) [8 . Điều phân tích cho thấy tỷ lệ phân bố genotype này có thể nghĩ tới giả thiết những trường và alen giữa hai nhóm bệnh và nhóm hợp vô tinh, không có tinh trùng ở nam chứng không khác biệt mang ý nghĩa giới VS có thể là hậu quả của rối loạn về thống kê (p > 0,05). Tuy nhiên, theo 296
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 nghiên cứu của tác giả trên, trường hợp (GSTP1 Leu105Val) của 2 nhóm có sự mang đột biến C481T gen NAT2 làm tăng khác biệt mang ý nghĩa thống kê cường tính nhạy cảm dẫn đến VS nam (p < 0,05). Tác giả kết luận có thể có sự khi có sự tiếp xúc với các chất oxy hóa kết hợp của đột biến gen GSTP1G313A như: khói thuốc lá (OR = 1,7; 95%CI = và nam giới VS. Nghiên cứu của Xiong D. 1,02 - 2,87; p = 0,042), lạm dụng rượu K và CS (2015) [11 , tỷ lệ đột biến gen (OR = 2,14; 95%CI = 1,08 - 4,27; p = GSTP1G313A ở các nhóm BN 0,029), lượng thức ăn ít chất xơ (OR = azoospermia, oligospermia đều lớn hơn 1,68; 95%CI = 1,01 - 2,79; p = 0,04) [45]. nhóm chứng. Kết quả có ý nghĩa thống kê Như vậy, có sự khác nhau giữa kết quả với p < 0,05. của chúng tối với nghiên cứu của Yarosh Nghiên cứu đột biến gen GSTP1 và CS (2014). Nguyên nhân có thể do G313A của Yarosh và CS (2014)[12 trên khác biệt về chủng tộc, địa chất, môi 203 bệnh nhân nam VS I và 227 người trường và tiếp xúc với các chất độc hại bình thường cho thấy đột biến gen này của người Việt Nam khác so với người làm tăng nguy cơ VS ở nam giới (OR = phương Tây, điều đó dẫn tới khác biệt về 1,50, 95% CI 1,02 - 2,20, p = 0.04). tỷ lệ xuất hiện đột biến gen cũng như ảnh Như vậy, kết quả nghiên cứu của hưởng của đột biến gen đến các trường chúng tôi phù hợp với các tác giả trên. VS nam. Điều này góp phần củng cố thêm giả thiết biến đổi gen GSTP1 G313A chuyển hóa Nghiên cứu đột biến GSTP1(G313A) xenobiotic là nguyên nhân dẫn đến VS trên 100 BN ở mỗi nhóm, chúng tôi thấy: nam. tỷ lệ mang gen GA ở nhóm bệnh 36%, nhóm chứng 16% với OR = 2,95; CI = KẾT LUẬN 1,51 - 5,75; p < 0,001. 14% ở nhóm bệnh Tần số xuất hiện kiểu gen ở nhóm mang kiểu gen AA, không gặp trường bệnh và nhóm chứng khác biệt có ý nghĩa hợp nào mang kiểu gen AA ở nhóm thống kê với X2: 14, 35 (NAT2) và 30,2 chứng với OR = 33,69, CI = 1,98 - (GSTP1). Tỷ lệ xuất hiện kiểu gen dị hợp 573,16. Kiểu gen GA+AA gặp ở nhóm tử và đồng hợp đột biến ở nhóm bệnh bệnh và nhóm chứng lần lượt là 50% và 51% (NAT2) và 50% (GSTP1). Trong khi 16% với OR = 5,25; CI = 2,71 - 10,19; p < đó ở nhóm chứng là 25% (NAT2) và 16% 0,005. Điều này cho thấy nguy cơ VS hay (GSTP1). gặp ở BN mang kiểu gen này. Nghiên Bước đầu nhận thấy có mối liên quan cứu của Feng Z và CA (2017) [10 về sự giữa các đột biến gen GSTP1 (313G>A kết hợp của các đột biến gen SPO11 và (I105V), NAT2 (481C>T (L161L) với VS GSTP1 đối với các trường hợp VS I ở nam. Các kiểu gen GA+AA(GSTP1) và nam giới, kết quả so sánh trên 216 BN và CT+TT (NAT2) có nguy cơ cao gây VS 198 người bình thường cho thấy tần suất nam với OR lần lượt là: 5,25 (95%CI: đột biến đơn thuần G313A gen GSTP1 2,71 - 10,19) và 3,12 (95%C I: 1,72 - 5,68). 297
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO 7. Brahem S, Mehdi M, Elghezai H et at. The effects of male aging on semen quality, 1 Ngô Xuân Bái, Nguyễn Thị Bình Nghiên spearm DNA framentation and choromosomal cứu đặc điểm tinh dịch và nông độ FSH, LH abnormalities in an infertile population. Journsl và Testosterone huyết thanh của người bị of Assisted Reproduction and Genetics. 28 nhược tinh. Bộ môn Mô phôi. Đại học Y Hà Nội. (5), pp.425-432. 2010. 8. Shalender Bhasin. Approach to the 2. Andrew D. Patterson, Frank J. Gonzalez, infertile Man.J Clin Endocrinol Metab. 2007, 92 (6), pp.1995-2004. Jeffrey R. Idle. Xenobiotic metabolism - A 9. Yarosh S.L, Kokhtenko E.V, Churnosov view through the metabolometer. Chem Res M.I et al. Synergism between the N- Toxicol. 2010 May 17, 23 (5), pp.851-860. acetyltransferase 2 gene and oxidant 3. H C. Schuppe, P Wieneke. Xenobiotic exposure increases the risk of idiopathic male metabolism, genetic polymorphisms and male infertility. Report Biomed Online. 2014, 29 (3), infertirity. Andrologia. 2000, vol 32, pp.255-262. pp.362-369. 4. Chen Z. H, Xian J. F, Luo L. P. 10. Feng Z, Jing Z, Liu H, Liao S. Association between GSTM1, GSTT1 and Association of SPO11 and GST gene GSTP1 polymorphisms and gastric cancer polymorphisms with idiopathic male infertility risk, and their interactions with environmental in ethnic Han Chinese. Zhonghua Yi Xue Yi factors. Genet Moi Res. 2017, 16 (1). Chuan Xue Za Zhi. 2015, 32 (6), pp.866-870. 5. Magalon H, PatinE, Austerlitz F. 11. Xiong D.K, Chen H.H, Ding X.P. Association of polymorphisms in glutathione Population genetic diversity of the NAT2 gene S-transferase genes (GSTM1, GSTT1, supports a role of acetylation in human GSTP1) with idiopathic azoospermia or adaptation to farming in Central Asia. oligospermia in Sichuan. China. Asian J European Journal Human Genetic. 2008, 16 Androl. 2015, 17 (3), pp.481-6. (2), pp.243-251. 12.Yarosh S.L, Kokhtenko E.V, Churnosov 6. Yufeng Qin. Interactions between Urinary M.I. Joint effect of glutathione S-transferase 4-tert-Octylphenol levels and metabolism genotypes and cigarette smoking on idiopathic enzyme gene variants on idiopathic male male infertility. Adrologia. 2015, 47 (9), infertility.Plos one. 2013, Vol 8. pp.980-986. 298