Khảo sát in silico, xây dựng cơ sở khoa học cho việc phát hiện kết hợp yếu tố nhiễm và bất ổn di truyền trong ung thư vòm họng

Nội dung text: Khảo sát in silico, xây dựng cơ sở khoa học cho việc phát hiện kết hợp yếu tố nhiễm và bất ổn di truyền trong ung thư vòm họng

1. TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 67 KHẢO SÁT IN SILICO, XÂY DỰNG CƠ SỞ KHOA HỌC CHO VIỆC PHÁT HIỆN KẾT HỢP YẾU TỐ NHIỄM VÀ BẤT ỔN DI TRUYỀN TRONG UNG THƯ VÒM HỌNG Ngày nhận bài: 17/06/2014 Nguyễn Văn Trường, Nguyễn Thị Thúy Tài, Ngày nhận lại: 05/07/2014 Nguyễn Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Thị Thu Ngân, Ngày duyệt đăng: 09/09/2014 Lý Thị Tuyết Ngọc1 Lao Đức Thuận2 Lê Huyền Ái Thúy3 TÓM TẮT Ung thư vòm họng là một dạng ung thư phổ biến ở Việt Nam với tỷ lệ tử vong khá cao lên đến 3,3% dân số vào năm 2012. Do vậy, việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư vòm họng là một vấn đề cấp thiết nhằm nâng cao khả năng sống sót của bệnh nhân. Các nghiên cứu gần đây khẳng định rằng sự xâm nhiễm của Epstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa bất thường trên gen DAPK là những nguyên nhân dẫn đến sự tăng sinh và phát triển khối u ở vòm họng. Với mục đích hướng tới việc phát triển một kỹ thuật chẩn đoán dựa trên việc kiểm tra sự hiện diện của gen EBNA-1 – một gen cần thiết cho sự xâm nhiễm và nhân lên của EBV – và sự methyl hóa bất thường trên gen DAPK như các dấu chứng sinh học trong tiên lượng và chẩn đoán sớm ung thư vòm họng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu bước đầu gồm (1) Khai thác dữ liệu, thống kê tần số methyl hóa trung bình có trọng số gen DAPK dựa trên các nghiên cứu trên thế giới; (2) Xác định phương thức thực nghiệm nhằm tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh ung thư vòm họng và khảo sát các bước in silico cần thiết. Từ khóa: ung thư vòm họng, EBV, EBNA-1, DAPK, methyl hóa. ABSTRACT Nasopharyngeal carcinoma is the common cancer in Vietnam counting for 3,3% in 2012. Therefore, there are necessary to prognosis and early diagnosis nasopharyngeal carcinoma in order to improve the survival of patients. Current studies affirmed that the infection of EBV (Epstein-Barr virus) and the aberrant methylation in DAPK gene were the reasons leading to the carcinogenesis of nasopharynx. For the aims to establish the method based on the present of EBNA-1 which was necessary to the infection and replication of EBV and the hypermethylation in DAPK as the biomarker for prognosis and early diagnosis nasopharyngeal carcinoma, in this study, we carried out (1) Data mining and statistically calculated the mean of methylation frequencies of DAPK based on the studies worldwide; (2) Determination of the mode of experiment for prognosis and early diagnosis the nasopharyngeal carcinoma. Keywords: nasopharyngeal carcinoma, EBV, EBNA-1, DAPK, methylation. 1 Trường Đại học Mở TP.HCM. 2 ThS, Trường Đại học Mở TP.HCM. 3 PGS.TS, Trường Đại học Mở TP.HCM. Email: lhathuy@gmail.com
2. 68 CÔNG NGHỆ 1. Giới thiệu của Wong et al (2002) đã cho thấy sự methyl Ung thư vòm họng là loại ung thư phổ hóa vượt mức trên promoter của gen DAPK ở biến, đứng đầu trong các bệnh ung thư cổ ở ung thư vòm họng là một sự kiện diễn ra sớm Việt Nam. Số liệu của năm 2012 cho thấy tỷ lệ trong quá trình sinh u ở vòm họng với sự mắc bệnh ung thư vòm họng và tử vong lần methyl hóa trên gen DAPK ở khối u sơ cấp [17] chiếm 75% và trên các dòng tế bào ung thư lượt lên đến 3,9% và 3,3% dân số . Cũng [16] như các ung thư khác, việc chẩn đoán sớm vòm họng chiếm 80% . bệnh ung thư vòm họng sẽ hứa hẹn cho sự Ngoài ra, một nguyên nhân khác nữa đã phục hồi và nâng cao khả năng sống sót của được xem là căn nguyên dẫn đến bệnh (ung bệnh nhân[13]. Các phương pháp thông thường thư vòm họng), đó là sự xâm nhiễm của virus như sinh thiết khối u có giá trị cao trong chẩn Epstein Barr (EBV)[3][10]. EBV là một loại đoán nhưng mang tính nhược điểm xâm lấn virus thuộc họ Herpesvirus. Cấu tr c ộ gen gây tổn thương cơ thể bệnh nhân và chỉ được của EBV là chuỗi sợi đôi, kích thước áp dụng cho các giai đoạn không còn sớm của 1 4k , mã hóa cho trên 85 gen[10]. Khi EBV bệnh (khối u đã hình thành)[13]. Song song đó, xâm nhập vào cơ thể người, sự phát triển của các nhà nghiên cứu trên thế giới đang hết sức EBV diễn tiến theo ba hướng (1) Xâm nhập nổ lực để tìm kiếm một biomarker nhằm tiên vào tế bào biểu mô và nhân lên; (2) Gây sơ lượng và chẩn đoán sớm bệnh. nhiễm và xâm nhập vào tế bào lympho B và nhân lên; (3) Tiềm tàng và tiến triển thành ung Các công bố gần đây đều khẳng định [10][19] nguyên nhân dẫn đến ung thư vòm họng là hệ thư khi có điều kiện . Để duy trì khả năng quả của sự rối loạn về mặt di truyền và một tiềm tàng, EBV đòi hỏi phải có sự trợ giúp của protein EBNA-1 được mã hóa trực tiếp từ gen trong những kiểu rối loạn di truyền đã được [14][19] chứng minh xảy ra rất sớm trong tiến trình dẫn EBNA-1 . Chi tiết hơn, EBNA-1 thể hiện đến ung thư là sự methyl hóa vượt mức xảy ra vai trò bằng việc duy trì EBV ở dạng vòng ở các gen ức chế khối u hay các gen tham gia (episome EBV) trong tế bào chủ và thực hiện vào quá trình điều hòa chu trình tế bào bằng sự chức năng trong phiên mã thông qua việc EBNA-1 bám vào oriP khởi phát sự nhân lên gắn nhóm methyl (-CH3) vào C5’ của Cytosine [7][14] thông qua liên kết cộng hóa trị[1][5][9][20]. Sự của DNA hệ gen EBV . Gen EBNA-1 và methyl hóa xảy ra tại các đảo CpG của các gen các sản phẩm của nó được tìm thấy trong hầu hết các khối u liên quan đến EBV; sự có mặt ức chế khối u, các gen điều hòa chu trình tế [20] bào dẫn đến sự mất chức năng của các gen của EBV được xác định lên tới 98% khối u . này, thúc đẩy sự tăng trưởng và phát sinh khối Chính vì vậy, có thể khẳng định rằng: yếu tố u[9]. Gen DAPK (Death Associated Protein nhiễm EBV là nguyên phát của bệnh ung thư Kinase) thuộc nhóm gen điều hòa chu trình tế vòm họng. bào, nằm ở vị trí 9q21.33, mã hóa cho protein Nhằm xây dựng cơ sở khoa học cho thực DAPK có chức năng trong việc điều khiển tế nghiệm phát hiện sớm và tiên lượng bệnh ung bào chết theo chương trình[15]. Sự methyl hóa thư vòm họng, trong nghiên cứu ước đầu này, trên gen DAPK đã được khẳng định là có liên chúng tôi tiến hành (1) Khai thác dữ liệu đã quan đến một số loại ung thư với các tần số được công bố trên thế giới liên quan đến sự methyl hóa khác nhau lần lượt như: ung thư hiện diện của EBNA-1 và sự methyl hóa vượt phổi với 34%[12], ung thư gan với 52%[18], u mức DAPK liên quan đến ung thư vòm họng; tuyến yên với 34%[2], ung thư vú với 17%[2]... (2) Xác định phương pháp chẩn đoán sớm Đối với ung thư vòm họng, tần số methyl hóa bệnh dựa trên hai gen đích: gen ENBA-1 (yếu gen này là rất cao; cụ thể trong công bố của tố nhiễm) và DAPK (yếu tố thể chủ). Kong et al (2006), tần số này chiếm 76,1%[15]. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên Một nghiên cứu khác của Zhang et al (2002) cứu cũng cho thấy sự methyl hóa vượt mức ở gen DAPK trên ung thư vòm họng chiếm tỷ lệ rất Khai thác dữ liệu, thu nhận trình tự cao, từ 70-80%[20]. Bên cạnh đó, nghiên cứu gen EBNA-1 và DAPK
3. TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 69 Tần số và các phương pháp đánh giá tuyến BLAST ( mức độ methyl hóa trên gen DAPK được khai IDT analyzer (www.idtdna.com/analyzer/ thác trên cơ sở dữ liệu Pubmed và Pubmed Applications/OligoAnalyzer/), Annhyb, central, từ đó, tần số trung bình có trọng số CLUSTALX, BatchPrimer 3 được tính toán. Các trình tự gen EBNA-1 được ( thu nhận từ Genbank trên cơ sở dữ liệu NCBI 3. Kết quả và thảo luận ( bằng các mã số truy cập KC207814, KC207813, NC_009334, Khai thác dữ liệu DQ279927, KF373730, JQ009376, Chúng tôi bắt đầu bằng việc tập trung KC617875. Đồng thời trình tự gen DAPK trên tính chất methyl hóa bất thường có liên cũng được thu nhận bằng mã số truy cập quan đến ung thư vòm họng. Qua quá trình NC_000009.12. khai thác dữ liệu từ các nghiên cứu trên thế Thiết kế mồi cho phản ứng PCR giới liên quan đến đánh giá mức độ methyl khuếch đại EBNA-1 và cho phản ứng MSP hóa, chúng tôi nhận thấy rằng gen DAPK có tỷ đánh giá mức độ methyl trên gen DAPK lệ methyl hóa cao vượt bậc. Bảng sau là tổng hợp từ các công bố điển hình về tỷ lệ methyl Việc thiết kế mồi được thực hiện bằng các hóa, phương pháp thực hiện với các nguồn công cụ tin sinh học bao gồm chương trình trực mẫu sử dụng trên gen này. Bảng 1. T lệ methyl h a ph ng pháp nguồn m u khác nhau giữa các nghiên cứu Tỷ lệ methyl hóa Nghiên Sôi mẫu Phương pháp Loại mẫu trên mẫu ung thư cứu ung thư/bình thường (%) Mô sinh thiết 49/- 67,3/- [3] MSP Dịch phết 49/20 55,1/0 [5] MSP Mô đúc paraffin 41/- 76,0/- Mô sinh thiết 30/- 76,7/- [6] MSP Dịch phết 30/- 63,4/- MSP, Real-Time Mô đúc paraffin, [7] 46/- 76,1/- PCR Mô sinh thiết [13] MSP Mô đúc paraffin 53/- 79,2/- [14] MSP Mô sinh thiết 32/- 75,0/- Ghi chú: - trong nghiên cứu không thử nghiệm trên nguồn mẫu bình thường Dựa trên kết quả thể hiện ở Bảng 1 cho đó, các công bố không ghi nhận được tỉ lệ thấy phần lớn các công bố đều sử dụng mẫu methyl hóa trên mẫu mô bình thường. Điều sinh thiết và mô đúc paraffin, chỉ duy nhất hai đáng chú ý là các công bố trên thế giới đều sử nghiên cứu sử dụng dịch phết để khảo sát. Kết dụng kỹ thuật MSP để phát hiện tính chất quả thống kê ghi nhận tỷ lệ methyl hóa trên methyl hóa trên gen DAPK, dù đã có nhiều kỹ gen DAPK đều rất cao và có sự dao động từ thuật khác được phát triển. Bên cạnh đó, công 55,1 đến 7 , giữa các công bố. rong khi bố của tác giả Zhang và cộng sự vào năm
4. 70 CÔNG NGHỆ 2012, các tác giả vẫn lựa chọn MSP[3]. Chúng khác biệt giữa các phương pháp nghiên cứu và tôi cũng thống nhất với lựa chọn này bởi MSP các loại mẫu, chúng tôi tính tần số trung bình nhạy, dễ phát triển và nhất là đơn giản nhưng có trọng số áp dụng cho các số liệu đã thống phân biệt được allele methyl (dù hiện diện ít) kê được. Kết quả cho thấy tần số methyl có trong hỗn hợp tế ào ung thư và tế bào bình trọng số là 72,02 và được thể hiện thông qua thường của mẫu bệnh phẩm. Nhằm loại bỏ sự Hình 1. Hình 1. Tần số methyl hóa có trọng số của gen DAPK trên tế bào ung thư vòm họng và tế bào bình thường Ghi chú: Tâm của các vòng tròn thể hiện tần số methyl hóa đã được báo cáo trong các công trình liên quan. Đường thẳng nằm ngang hiển thị tần số methyl hóa trung bình có trọng số dựa trên các nghiên cứu mà chúng tôi phân tích. Điều đáng đặc biệt lưu ý là trong tất cả Trình tự gen DAPK được thu nhận từ các công bố về tính chất methyl hóa bất ngân hàng gen với mã số truy cập thường của gen DAPK, các tác giả đã không đề NC_000009.12 (Hình 2). Đồng thời, các vùng cập đến yếu tố nguyên phát, tức là nhiễm EBV promoter, exon 1 và 5’UTR được xác định của mẫu bệnh phẩm. bằng các công cụ hỗ trợ trực tuyến Sequence view trên NCBI (Dữ liệu không trình bày). Thu nhận trình tự gen DAPK và thiết kế mồi MSP đánh giá mức độ methyl h a trên gen DAPK Hình 2. Vị trí gen DAPK nằm trên nhiễm sắc thể số 9 Các đảo CpG thuộc vùng promoter của (-292 đến +370) kéo dài từ vùng cuối promoter gen được xác định bằng phần mềm 1 đến cuối exon 1 (Hình 3). Methprimer, đảo CpG có chiều dài 662 bp
5. TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 71 Hình 3. Sơ đồ cấu trúc gen DAPK Bên cạnh đó, kiểm tra bằng phần mềm kế đánh giá tình trạng methyl hóa tại vị trí các TF search, nhiều vị trí phiên mã quan trọng đảo CpG sẽ đi qua các nhân tố phiên mã quan Sp1, MZF, CP2, ANML1a, p300, C/EBP, trọng. Đối với phản ứng MSP, hệ thống mồi GATA, được nhận diện nằm ên trong đảo bao gồm mồi methyl và mồi unmethyl để phân CpG của gen DAPK (Hình 4.). Các nhân tố biệt được tình trạng methyl hóa hay không phiên mã này hiện diện trong vùng promoter, methyl hóa của các vị trí CpG trong vùng khảo vì vậy việc ”đóng” hay ”mở” của chúng sẽ sát. Điểm khác biệt duy nhất giữa hai mồi quyết định đến hoạt động phiên mã và biểu methyl và unmethyl là nucleotide Cytosine hiện của gen, do đó, ch ng tôi sẽ chọn vùng trong trình tự mồi methyl sẽ được thay thế này để đánh giá mức độ methyl hóa tại các vị bằng các Thymine trong trình tự mồi trí CpG có thể gây ức chế quá trình phiên mã unmethyl. Trình tự các cặp mồi được thể hiện dẫn đến sự im lặng của các gen thông qua ở Bảng 2. phương pháp MSP. Từ đó, các mồi được thiết Bảng 2. Trình tự mồi methyl (I) và unmethyl (II) dùng để khuếch đại gen DAPK Cặp mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) DAPK-MF GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC (I) DAPK-MR CATAAACGCCAACGCCGAAAA DAPK-UF GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT (II) DAPK-UR CCATAAACACCAACACCAAAAA Ghi chú: Các vị trí CpG được in đậm và gạch dưới; Các cặp mồi dùng trong phương pháp MSP được kí hiệu là F–mồi xuôi. R–mồi ngược; M–methyl; U–unmethyl Cặp mồi methyl và unmethyl được tiến tuyến I T analyzer và đánh giá độ đặc hiệu hành đánh giá các thông số vật lý bao gồm thông qua chương trình trực tuyến BLAST hay chiều dài, phần trăm GC, năng lượng tự do hình METHBLAST trên NCBI (Bảng 3). thành cấu trúc thứ cấp,... bằng công cụ trực
6. 72 CÔNG NGHỆ Bảng 3. Đánh giá thông số vật lý mồi methyl và unmethyl gen DAPK o Tên mồi Tm ( C) L %GC (1) (2) (3) Sản phẩm (bp) DAPK-MF 56,5 24 50,0 - 0,41 - 7,53 - 8,26 172 DAPK-MR 56,9 21 47,6 - 0,51 - 3,61 DAPK-UF 54,8 27 37,0 0,15 - 4,85 - 8,31 176 DAPK-UR 52,1 22 36,4 -0,51 -1,47 Ghi chú: Năng lượng tự do ∆G (Kcal.mole-1) hình thành (1) hairpin loop; (2) homodimer và (3) heterodimer; Tm: nhiệt độ nóng chảy, L: chiều dài (bp), %GC: phần trăm GC. Dựa trên kết quả phân tích các thông số trong mồi, mồi xuôi và mồi ngược được thiết vật lý của mồi (Bảng 3.), phần lớn các thông kế bao phủ ít nhất ba vị trí CpG, cụ thể đối với số vật lý đều phù hợp với các yêu cầu lý thuyết mồi xuôi methyl và unmethyl chứa 4 vị trí đặt ra[11]. Chỉ duy nhất %GC của cặp mồi CpG và mồi ngược chứa 3 vị trí CpG. Cùng unmethyl thấp hơn so với quy định là 50-60%, với tính chất hệ thống mồi này được thiết kế do đó, trong thực nghiệm sau này sẽ lưu ý chứa các vị trí CpG trùng với vị trí của các trong việc tối ưu hóa các thông số của phản nhân tố phiên mã quan trọng như CP2, MZF1 ứng MSP. Ngoài ra, khi kiểm tra tính đặc hiệu làm tăng độ đặc hiệu cũng như khả năng đánh bằng chương trình BL ST và METHBL ST giá tình trạng methyl hóa ở tế ào ung thư vòm đều thể hiện tính đặc hiệu cao (Dữ liệu không họng (Hình 4). trình bày). Mặt khác, về số lượng các CpG Hình 4. Vị trí bắt cặp mồi methyl và unmethyl, các nhân tố phiên mã quan trọng trên gen DAPK Ghi chú: Các nucleotide được đóng khung trong hộp hình chữ nhật là các vị trí của các yếu tố phiên mã, trình tự nucleotide màu đen là toàn bộ trình tự đảo CpG thu thập được. rong đó, hai đoạn trình tự được tô đậm là vị trí b t cặp của hai đoạn mồi methyl (DAPK-M và DAPK-M ), đoạn trình tự được gạch chân bên dưới là vị trí b t cặp của hai đoạn mồi unmethyl (DAPK-U và DAPK-UR).
7. TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 73 hư vậy, ch ng tôi đã thành công trong hiện chức năng. Vì vậy, ước khảo sát in silico việc thiết kế cặp mồi methyl và unmethyl để kế tiếp, chúng tôi tập trung trên gen EBNA-1, đánh giá tình trạng methyl hóa trên gen DAPK nhằm xác định xem gen này có thể làm trình tự của ung thư vòm họng để sử dụng trong các đích cho sự xác nhận tính nhiễm và hình thức nghiên cứu thực nghiệm sau này. xâm nhiễm tiềm tàng của EBV. Xác định phương thức thực nghiệm Trình tự gen EBNA-1 được tiến hành thu nhằm tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh nhận từ các mã số truy cập khác nhau (như đã ung thư vòm họng liệt kê trong phần Vật liệu & Phương pháp) hư đã đề cập ở trên, sự có mặt của dựa trên nguồn gốc công bố có tính phân biệt EBV đã được chứng minh về tính tương quan về chủng hay type nhiễm. Các trình tự này rất cao (trên 98%) ở các khối u vòm họng[20]. được tiến hành sắp gióng cột bằng chương Mặt khác, để duy trì hình thức xâm nhiễm tiềm trình CLUSTALX (Hình 5). tàng với DNA dạng vòng, gen EBNA-1 cần thể Hình 5. Kết quả sắp gióng cột các trình tự gen EBNA-1 Kết quả sắp gióng cột các trình tự đó, có thể kết luận rằng, vùng bảo tồn thuộc EBNA-1 (Hình 5) cho thấy tỷ lệ bảo tồn của gen EBNA-1 này có đủ cơ sở để làm trình tự gen này khá cao (thể hiện thông qua dấu * đích nhằm phát hiện EBV. Việc thiết kế mồi trong hình). Ngoài ra, các trình tự bảo tồn của cho các phản ứng RT-PCR được tiến hành và gen này đều rất đặc trưng cho EBV khi khảo kết quả được thể hiện trong Bảng 4. sát bằng BLAST (dữ liệu không trình bày). Do Bảng 4. Trình tự mồi cho phản ứng PCR khuếch đại một phần gen EBNA-1 Cặp mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) EBNA1_F GCCGGTGTGTTCGTATATGG EBNA1_R AGGGGAGACGACTCAATGGT Ghi chú: F mồi xuôi; R mồi ngược Các thông số vật lý của cặp mồi EB 1_F và EB 1_R được kiểm tra bằng chương trình IDT analyzer và thể hiện ở Bảng 5. Bảng 5. Kết quả thông số vật lý của cặp mồi EBNA1_F và EBNA1_R Trình tự mồi (5’-3’) L %GC Tm (oC) (1) (2) (3) Sản phẩm (bp) EBNA1_F6 20 55,0 55,8 1,18 -9,75 -6,53 109 EBNA1_R6 20 55,0 57,9 -1,65 -3,61 Ghi chú: Năng lượng tự do ∆G (Kcal.mole-1) hình thành (1) hairpin loop; (2) homodimer và (3) heterodimer; Tm: nhiệt độ nóng chảy, L: chiều dài (bp), %GC: phần trăm GC.
8. 74 CÔNG NGHỆ Dựa trên kết quả phân tích, các thông số vòm họng sẽ dựa trên hai gen đích: gen EBNA- vật lý đều phù hợp với yêu cầu của thiết kế 1 (yếu tố nhiễm) và DAPK (yếu tố thể chủ) mồi, ngoại trừ năng lượng tự do hình thành bằng các phản ứng kết hợp RT-PCR và MSP. cấu trúc homodimer là -9,75 < -9 Kcal.mole-1. 4. Kết luận Tuy nhiên, khi tiến hành kiểm tra bằng phần mềm trực tuyến IDT, cấu trúc tự bắt cặp xảy ra Từ những kết quả nghiên cứu ước đầu, ở đầu 5’ và giá trị năng lượng tự do này không chúng tôi ghi nhận tần số methyl hóa trung chênh lệch quá nhiều so với yêu cầu (-9 bình có trọng số của gen DAPK là cao, đạt Kcal.mole-1). o đó, cặp mồi này vẫn được sử 72,02%. Cùng với tính chất methyl hóa cao dụng để kiểm tra tính đặc hiệu. Khi tiến hành này, sự biểu hiện của gen EBNA-1 được ghi kiểm tra tính đặc hiệu bằng chương trình trực nhận là đảm bảo tính nhiễm ở dạng tiềm tàng, tuyến BLAST, kết quả cho thấy mồi khuếch DNA dạng vòng của EBV trong cơ thể chủ. đại được gen EBNA-1 của virus human hepes Kết hợp cả hai yếu tố này, ch ng tôi xác định (Mã số truy cập J 9 6951, J 9 6949...) có độ phương thức thực nghiệm nhằm tiên lượng và tương đồng cao, đạt 100% và giá trị E-value chẩn đoán sớm ung thư vòm họng sẽ dựa trên gần bằng 0 (Ident=100%, E-value=0,089). hai gen đích: gen EBNA-1 (yếu tố nhiễm) và hư vậy, về mặt lý thuyết, ch ng tôi đã thiết DAPK (yếu tố thể chủ) bằng các phản ứng kết kế thành công cặp mồi khuếch đại gen EBNA- hợp RT-PCR và MSP với các bộ mồi đặc 1 thỏa mãn với các yêu cầu về thông số, tính trưng đã được thiết kế và đánh giá tốt trên lý đặc hiệu của mồi. Qua đó, ch ng tôi cũng thuyết. Kết quả khảo sát in silico này cũng là đồng thời xác định phương thức thực nghiệm cơ sở khoa học để chúng tôi tiến hành thực nhằm tiên lượng và chẩn đoán sớm ung thư nghiệm trong thời gian sớm nhất. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chang HW., Chan ., Kwong L., Wei WI., Sham JS., Yuen P. (2003). “Evaluation of hypermethylated tumor suppressor genes as tumor markers in mouth and throat rinsing fluid, nasopharyngeal swa and peripheral lood of nasopharyngeal carcinoma patient”. Int J Cancer 105, p.851– 855. 2. Chim CS., Liang R., Fung TK., Choi CL., Kwong YL. (2007). “Epigenetic dysregulation of the death-associated protein kinase/p14/HDM2/p53/Apaf-1 apoptosis pathway in multiple myeloma”. J Clin Pathol, 60 p.664-669. 3. Eugene AC., Julie MW., David ET., Stacey LI. (200 ). “ asopharyngeal Carcinoma: The Role of the Epstein-Barr Virus”. Medscape J Med., 10(7), p.165. 4. Kong WJ., Zhang S., Guo CK., Wang YJ., Chen X., Zhang SL., Zhang D., Liu Z., Kong W. (2006). “Effect of methylation-associated silencing of the death-associated protein kinase gene on nasopharyngeal carcinoma”. Anticancer Drugs 17(3), p.251-259. 5. Kwong J., Lo KW., To KF., Teo PM., Johnson PJ., Huang P. (2002).”‘Promoter Hypermethylation of Multiple Genes in asopharyngeal Carcinoma’. Clin Cancer Res, 8, p.131-137. 6. Leah CP., Marcie JG., Leah AD., Daniel EJ., Kieu D., Carmen ST., Steven AB. (2009). “ ual promoter regulation of death-associated protein kinase gene leads to differentially silenced transcripts y methylation in cancer”. Carcinogenesis, 30(12), p. 2023–2030. 7. Leight ER., Sugden B. (2000). “EB -1: a protein pivotal to latent infection by Epstein- Barr virus’. Rev Med Virol, 10, p.83-100.
9. TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 6 (39) 2014 75 8. Liu JB., Qiang FL., ong J., Cai J., Zhou SH., Shi MX. (2011) ‘Plasma methylation of Wnt antagonists predicts recurrence of esophageal squamous cell carcinoma’. World J Gastroenterol., 17(44), p.4917-4921. 9. Manel E. (2005). “ methylation, epigenetics and metastasis”. Springer, ISBN-10 1- 4020-3641-8. 10. Matthew PT., Razelle K. (2004). “Epstein-Barr Virus and Cancer”. Clin Cancer Res, 10, p.803-821. 11. Misener S., Krawetz S . (1999). “Methods in Molecular Biology’. © Humana Press, 132, p.365-386. 12. Niklinska W., Naumnik W., Sulewska A., Kozlowski M., Pankiewicz., Milewski R. (2009). “Prognostic significance of PK and R SSF1 promoter hypermethylation in Non-Small Cell Lung Cancer ( SCLC)”. Folia histochem cytobiol., 47, p.275-280. 13. Saeid G., Ali MA. (2012). “ on-Invasive Detection of Esophageal Cancer using Genetic Changes in Circulating Cell-Free ”. Avicenna J Med Biotechnol., 4(1), p.3-13. 14. Sivachandran N., Wang X., Frappier L. (2012). “Functions of the Epstein-Barr virus EB 1 protein in viral reactivation and lytic infection”. J Virol., 86(11), p.6146-6158. 15. Susanna HH., Sagung RI., Luh PLI., Ahma H., Sylvia D., Sofia MH., Renske DMS., strid EG., Jaap MM. (2011). “Epigenetic markers for early detection of nasopharyngeal carcinoma in a high risk population”. Molecular Cancer, 10, p.48. 16. Wong TS, Chang HW, Tang KC, Wei WI, Kwong DL, Sham JS, Yuen AP, Kwong YL. (2002). “High frequency of promoter hypermethylation of the death-associated protein- kinase gene in nasopharyngeal carcinoma and its detection in the peripheral blood of patients”. Clin Cancer Res., 8(2), p.433-437. 17. World Health Oragnization (2012). “Estimated cancer incidence, Mortality and prevalence worldwide in 2012”. International agency for research on cancer. 18. Wu LM., Zhang F., Zhou L., Yang Z., Xie HY., Zheng SS. (2010). “Predictive value of CpG island methylator phenotype for tumor recurrence in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma following liver transplantation”. BMC Cancer, 10, p.1471-2407. 19. Young LS., Dawson CW., Clark D., Rupani H., Busson P., Tursz T., Johnson A., Rickinson AB. (19 ). “Epstein-Barr virus gene expression in nasopharyngeal carcinoma”. J Gen Virol., 69(5), p.1051-1065. 20. Zhang Z., Sun D., Hutajulu SH., Nawaz I., Nguyen Van D., Huang G., Haryana SM., Middeldorp JM., Ernberg I., Hu LF. (2012). “ evelopment of a on-Invasive Method, Multiplex Methylation Specific PCR (MMSP), for Early Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma”. PLoS ONE, 7(11), p.1-6.