Kết quả tinh chế, đánh giá tính an toàn và hiệu quả huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (naja siamensis) trên thực nghiệm

Nội dung text: Kết quả tinh chế, đánh giá tính an toàn và hiệu quả huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (naja siamensis) trên thực nghiệm

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 KẾT QUẢ TINH CHẾ, ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU QUẢ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (NAJA SIAMENSIS) TRÊN THỰC NGHIỆM Lê Khắc Quyến*; Trịnh Xuân Kiếm** Hoàng Anh Tuấn***; Thái Danh Tuyên**** TÓM TẮT Mục tiêu: nghiên cứu xây dựng quy trình tinh chế huyết thanh kháng nọc (HTKN) rắn Hổ mèo (RHM) (Naja siamensis antivenom); đánh giá tính an toàn và hiệu lực của thuốc trong phòng thí nghiệm và trên thực nghiệm. Phương pháp: huyết tương ngựa đã có kháng thể đặc hiệu với nọc RHM hiệu giá cao thu được sau gây miễn dịch, tinh chế thành HTKN RHM F(ab’)2 bằng phương pháp sử dụng men pepsin và tủa bằng muối ammonium sulfate theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Đánh giá HTKN RHM về tính an toàn, hiệu lực theo đơn vị (LD50 và ED50), chất gây sốt trên động vật thực nghiệm và đặc tính vô khuẩn trong phòng thí nghiệm theo Tiêu chuẩn Kiểm định Quốc gia. Kết quả: thiết lập được quy trình tinh chế HTKN RHM F(ab’)2 và tinh chế thành công 157 lọ HTKN RHM dưới dạng dung dịch và đông khô. Thử nghiệm đánh giá trong phòng thí nghiệm (in vitro) và trên động vật thực nghiệm (in vivo) cho thấy HTKN RHM có tính an toàn cao, hiệu lực mạnh, vô khuẩn và không có chất gây sốt. Kết luận: HTKN RHM được tinh chế thành công và đánh giá đạt tiêu chuẩn quốc gia. Thành công của nghiên cứu mở ra một hướng điều trị đặc hiệu cho BN bị nhiễm độc nọc RHM trong tương lai. * Từ khoá: Rắn Hổ mèo; Huyết thanh kháng nọc; An toàn; Hiệu lực. Result of Purification, Assessment of Safety and Effective Tests of Naja Siamensis Antivenom In Vitro and In Vivo Summary Objectives: The study established the purification of F(ab’)2 Naja siamensis (NS) antivenom and gave an assessment of safety and potency tests of this antivenom in vitro and in vivo. Methods: Horse hyper-immune plasma against NS venom was collected after immunization, purified into NS antivenom F(ab’)2 by using pepsin digestion and ammonium sulfate precipitation based on World Health Organization (WHO) guidelines. An assessment of NS antivenom for safety, potency based on units of median lethal dose (LD50) and median effective dose (ED50), pyrogens tests in vivo and sterility test in vitro under quality control of the National Standard. Results: * Bệnh viện FV ** Viện Nghiên cứu Công nghệ Phát triển Nông thôn *** Học viện Quân y **** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Lê Khắc Quyến (lekhacquyen@yahoo.com) Ngày nhận bài: 20/05/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/09/2015 Ngày bài báo được đăng: 30/11/2015 45
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Established a protocol for purification of F(ab’)2 Naja siamensis antivenom and made successfully 157 liquid and lyophilized vials of NS antivenom. An assessment of this antivenom in vitro and in vivo showed high safety, strong efficacy, sterility and no pyrogens. Conclusion: Naja siamensis antivenom was made successfully and met National standard. The success of this study open the trend of antidote treatment for NS envenomed patients in future. * Key words: Naja siamensis; Antivenom; Safety; Efficacy. ĐẶT VẤN ĐỀ và hiệu lực trung hòa nọc độc in vitro và in vivo trên động vật thực nghiệm theo Năm 2009, WHO xếp rắn độc cắn vào tiêu chuẩn Quốc gia cũng như hướng dẫn bệnh lý nhiệt đới bị lãng quên và tái của WHO, góp phần giải quyết vấn đề khẳng định HTKN rắn độc là biện pháp thiếu HTKN RHM trong điều trị BN bị loài điều trị đặc hiệu duy nhất cho nhiễm độc rắn độc này cắn ở nước ta hiện nay. nọc rắn [9,10]. Việc không có sẵn các HTKN đặc hiệu để điều trị nhiễm độc do ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP các loài rắn ở các khu vực trên thế giới NGHIÊN CỨU trở thành một vấn đề y tế cấp thiết mức độ toàn cầu [10]. Từ năm 1894, lần đầu 1. Đối tƣợng nghiên cứu. tiên trên thế giới Calmette đã nghiên cứu - Huyết tương ngựa đã có kháng thể sản xuất thành công HTKN rắn Hổ tại đặc hiệu đơn giá kháng nọc RHM hiệu giá Viện Pasteur Sài Gòn [4]. Từ đây, điều trị cao được tạo ra trong nghiên cứu trước rắn độc cắn đã bước sang trang mới của chúng tôi [2]. Thu nhận huyết tương bằng thuốc đặc trị HTKN [8]. Ở Việt Nam, trong điều vô khuẩn, chống đông bằng nhóm nghiên cứu do Trịnh Kim Ảnh, Trịnh heparin, được ly tâm tách khối hồng cầu Xuân Kiếm và CS đã thành công trong ngay sau khi lấy máu từ 24 - 48 giờ, bảo việc nghiên cứu sản xuất HTKN rắn Hổ quản ở nhiệt độ 2 - 4°C liên tục cho đến đất từ năm 1990 tại Bệnh viện Chợ Rẫy khi sử dụng. [3]. Tiếp theo, HTKN rắn Choàm quạp, - HTKN RHM sau tinh chế, lấy ngẫu Hổ chúa, rắn Lục và rắn Cạp nia lần lượt nhiên 30 mẫu. được sản xuất, giúp giảm tỷ lệ tử vong - Nọc RHM do Công ty Cổ phần Y học cho bệnh nhân (BN) bị rắn độc cắn vào công nghệ KLT cung cấp. điều trị tại Bệnh viện Chợ Rẫy từ 20% - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Saboraud, xuống còn 2,7% [7]. Tuy nhiên, nhiễm nọc Thioglycolate) và vi nấm do Bệnh viện độc do RHM (Naja siamensis) cắn chiếm tỷ lệ 10% vẫn là một khó khăn rất lớn cho Chợ Rẫy cung cấp. bác sỹ lâm sàng trong điều trị, vì thiếu - Chuột nhắt trắng cân nặng từ 18 - HTKN đặc hiệu. Vì vậy, sản xuất HTKN 20 g/con (120 con), chuột lang cân nặng RHM là một nhu cầu cấp thiết từ thực tiễn 200 - 250 g/con (3 con) và thỏ cân nặng lâm sàng hiện nay. Mục tiêu của nghiên 1,75 - 2,0 kg/con (3 con) do Ban Cung cứu: Xây dựng quy trình sản xuất HTKN cấp Động vật thí nghiệm, Học viện Quân y RHM tại Việt Nam, đánh giá về tính an toàn cung cấp. 46
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. Ngày thí nghiệm, tiêm HTKN RHM là * Loại hình nghiên cứu: thành phẩm nghiên cứu vào tĩnh mạch rìa tai thỏ với thể tích V = 3 ml/kg cân nặng. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và Đo nhiệt độ hậu môn thỏ trước và sau khi thực nghiệm trên động vật. tiêm HTKN, thời gian cách nhau 1 giờ. * Nội dung nghiên cứu: Quy định: chênh lệch nhiệt độ cao nhất và - Xác lập quy trình tinh chế HTKN RHM thấp nhất 1°C, dạng F(ab’)2. chắc chắn do chất gây sốt gây ra. - Đánh giá HTKN RHM về hiệu lực - Vô trùng: cấy HTKN phát hiện vi khuẩn theo đơn vị (LD và ED ) và tính an toàn 50 50 trên môi trường Saboraud, Thioglycolate (chất gây sốt trên động vật thực nghiệm, và nấm tại Phòng Thí nghiệm, Khoa Vi sinh, tính vô khuẩn). Bệnh viện Chợ Rẫy. * Phương pháp tiến hành: - Tính an toàn: 03 chuột lang khoẻ, - Tinh chế HTKN RHM F(ab’) theo 2 cân nặng từ 200 - 250 g. Nuôi 1 tuần hướng dẫn của WHO (2010) bằng phương pháp sử dụng enzym pepsin và kết tủa trước khi thí nghiệm. Tiêm HTKN RHM bằng muối ammonium sulfate [9]. vào phúc mạc chuột, V = 2 ml/100 g x cân nặng chuột. Theo dõi chuột trong 3 tuần - Đánh giá tại cơ sở theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (2009) [1] và theo về cân nặng và rụng lông. Chuột vẫn phát hướng dẫn của WHO (2010) [9]. triển bình thường và tăng cân là HTKN an toàn trên động vật thí nghiệm. - Tính LD50: theo công thức Spearman- Karber [1]. * Dụng cụ và trang thiết bị: - Tính ED50: - Thiết bị chuyên dùng tinh chế HTKN: + Pha HTKN RHM tăng dần từ 10 μl/ml buồng lạnh vô trùng, bồn nước thay đổi đến 60 μl/ml. nhiệt độ, pH meter, bồn inox vô trùng chứa + Dung dịch nọc RHM pha trong dung huyết tương ngựa, phễu lọc, giấy lọc, dịch nước muối đẳng trương 0,9% màng lọc cellulose acetate, tủ sấy hấp (10 mg% = 100 µg/ml), trộn đều với từng dụng cụ, máy hút, bình lọc, dụng cụ sát độ pha loãng HTKN, cùng thể tích. Ủ hỗn trùng, đèn cồn, hệ thống đông khô lạnh dịch trên ở 37°C trong 1 giờ. (Christ ly°Chameer Guard), lọ đựng HTKN + Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột (dung dịch thành phẩm, nút cao su vô trùng. nọc + HTKN), V = 0,5 ml/chuột. - Thiết bị, dụng cụ, động vật thí nghiệm + Số chuột thí nghiệm 8 con/lô x 4 lô. dùng để đánh giá chất lượng HTKN RHM. + Theo dõi trong 24 giờ, ghi nhận số - Hoá chất chuyên dụng: pepsin (Merck), chuột chết/sống, tính tỷ lệ (%). ammonium sulfat (Merck), axít sulfuric, - Tìm chất gây sốt: 03 thỏ khoẻ mạnh, axít chlorhydric, NaOH, toluen, nước cất cân nặng 1,75 - 2,0 kg, nuôi trong 1 tuần. vô trùng. 47
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 * Thời gian và địa điểm: - Tủa thành phần không phải kháng - Thời gian: từ tháng 07 - 2012 đến thể bằng ammonium sulfate: cho từ từ 10 - 2013. 1.400 g ammonium sulfate vào 10 lít huyết tương. Hòa tan bằng que khuấy thủy tinh, - Địa điểm tiến hành: đảm bảo vô khuẩn tốt. + Bộ môn Khoa Huyết Học - Truyền máu, - Khử bổ thể bằng nhiệt ở 56°C/60 phút. Bệnh viện Quân y 103. - Lọc huyết tương, thu dịch lọc có kháng + Phòng Protein - Độc chất - Tế bào, thể đặc hiệu, loại bỏ cặn thu được 8 lít. Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y. - Tủa kháng thể bằng thêm ammonium sulfate tới 36% bão hòa: thêm ammonium + Bộ môn Độc học và Phóng xạ Quân sulfate trong dịch lọc, ủ ở 20°C, pH 6,8/60 sự, Học viện Quân y. phút. Lọc dịch, thu tủa được 600 g. + Khoa Vi sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy. - Thẩm tích bằng màng cellulose acetate để loại bỏ ammonium sulfate. Thu hồi dịch KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU thẩm tích được 798 ml. 1. Xác lập quy trình tinh chế HTKN - Lọc vô trùng bằng màng cellulose RHM F ab’ 2. acetate, Φ = 0,2 µm. Thu được 785 ml - Cắt Fc của phân tử kháng thể IgG HTKN RHM F(ab’)2. Đóng lọ vô trùng: trong huyết tương ngựa bằng enzym 157 lọ, bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8°C. pepsin: 10 lít huyết tương ngựa có hiệu - Đông khô HTKN RHM: đặt 100 lọ giá kháng thể đặc hiệu cao với nọc RHM, dung dịch HTKN thành phẩm vào hệ thống trộn đều cùng 100 g pepsin, duy trì pH đông khô lạnh Chris, trong 53 giờ. Thu huyết tương bằng 3,2 ở nhiệt độ 20°C/60 được 92 lọ HTKN RHM dạng đông khô, phút, đảm bảo vô khuẩn. 08 lọ bị mất dịch, tỷ lệ hao hụt 8/100 = 8%. 2. Hiệu lực (potency) của HTKN RHM. * Liều chết 50% (Lethal dose-LD50) của nọc RHM Việt Nam: Bảng 1: Xác định LD50 của nọc RHM Việt Nam. STT Nồng độ Số lƣợng Theo dõi chuột thí nghiệm Tỷ lệ chuột lô nọc μg/ml nọc/chuột (µg) chết (%) Sống Chết Tổng 1 0 0 4 0 4 0 2 60 6 4 0 4 0 3 70 7 4 0 4 0 4 80 8 4 0 4 0 5 90 9 4 0 4 0 6 100 10 3 1 4 25 48
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 7 110 11 2 2 4 50 8 120 12 2 2 4 50 9 130 13 2 2 4 50 10 140 14 1 3 4 75 11 150 15 0 4 4 100 12 160 16 0 4 4 100 13 250 25 0 4 4 100 14 500 50 0 4 4 100 Số chuột thí nghiệm/lô = 4 con. Thể tích dịch nọc tiêm chuột = 0,5 ml. Tính toán kết quả từ bảng 1 cho giá trị LD50 của nọc RHM Việt Nam = 12 µg/chuột (20 g). * Hiệu lực (Effective dose-ED50) của HTKN RHM: Bảng 2: Xác định ED50 của HTKN RHM. Theo dõi chuột thí nghiệm HTKN RHM Dung dịch NaCl Nọc RHM Số LD50/ (ml) 0,9% (ml) (8,33 LD50) (ml) chuột Chết Sống Tổng số 0,05 3,75 1,20 1 0 8 8 0,03 3,77 1,20 1 0 8 8 0,01 3,79 1,20 1 0 8 8 0,00 3,80 1,20 1 4 4 8 ED50 = 100 LD50 /ml = 1.200 µg/ml = 500 LD50/lọ = 6.000 µg/lọ. Kết quả: - 01 ml HTKN RHM có khả năng trung hòa 100 LD50 = 1.200 µg nọc RHM. - 01 lọ HTKN RHM (5 ml) sẽ trung hòa được 500 LD50 = 6.000 µg nọc RHM. 3. Độ an toàn của HTKN RHM. * Kiểm tra chất gây sốt (pyrogen test): Bảng 3: Xác định HTKN RHM không có chất gây sốt. o Thứ tự Cân nặng Thể tích tiêm Nhiệt độ thỏ trƣớc/sau khi tiêm HTKN RHM ( C) Nhiệt độ thỏ (kg) HTKN (ml) Trước Sau 1 giờ Sau 2 giờ Sau 3 giờ chênh lệch 1 1,75 5,25 39,0°C 38,8°C 39,5°C 39,5°C + 0,5°C 2 1,80 5,40 39,9°C 39,5°C 39,4°C 39,4°C - 0,5°C 3 1,90 5,70 39,3°C 39,2°C 39,2°C 39,45°C + 0,15°C Trong 3 giờ liên tiếp, nhiệt độ thay đổi của thỏ sau tiêm HTKN RHM < 1°C. Kết quả cho thấy HTKN RHM không có chất gây sốt. 49
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 * Kiểm tra tính an toàn (safety test): Bảng 4: Thử nghiệm an toàn của HTKN RHM trên chuột lang. Theo dõi chuột thí nghiệm Thứ Cân nặng HTKN Thay đổi cân Cân nặng (g) tự ban đầu (g) (ml) Rụng lông nặng (g) Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 1 210 4,2 Không 215 220 230 + 20 2 200 4,0 Không 205 210 230 + 30 3 220 4,4 Không 230 240 245 + 25 Kết quả cho thấy cả 03 chuột lang thí nghiệm đều phát triển bình thường, tăng cân, không bị rụng lông, không có biểu hiện bệnh lý, chứng tỏ HTKN RHM an toàn trên chuột thí nghiệm. * Kiểm tra vô trùng (sterility test): Cấy HTKN RHM trong môi trường Saboraud (20 - 25°C), thioglycolate (30 - 35°C) và nấm tại Phòng Vi Sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy. Theo dõi liên tục phát hiện vi khuẩn và nấm trong 07 ngày không phát hiện được vi khuẩn ái khí, kỵ khí và nấm mốc mọc trong các môi trường đã cấy HTKN nghiên cứu. Như vậy, HTKN RHM là sản phẩm nghiên cứu bảo đảm vô khuẩn, không có nấm mốc. BÀN LUẬN HTKN dạng Fab tạo ra bằng cách sử dụng enzym papain tuy có nhiều ưu điểm 1. Chọn lựa quy trình tinh chế HTKN ít tác dụng phụ thải trừ nhanh nên lâm dạng F(ab') bằng enzym pepsin và tủa 2 sàng có tình trạng tái nhiễm độc và các bằng ammonium sulfate. biến chứng trên thận do đường thải trừ, - HTKN rắn thường được sản xuất dưới hiệu lực cao nhưng giá thành rất cao. Do dạng IgG, F(ab')2 và Fab tùy theo quy đó, nghiên cứu này chọn lựa quy trình trình sản xuất của các nhà sản xuất, tùy sản xuất F(ab')2 sử dụng enzym pepsin và cơ sở vật chất và tùy tình hình kinh tế của tủa ammonium sulfate. Quy trình này dựa mỗi quốc gia [5, 9]. Hiện nay, HTKN rắn trên kinh nghiệm sản xuất các loại HTKN dạng F(ab')2 được nhiều nhà sản xuất trước đây, có nhiều ưu điểm cho sản chọn lựa vì có nhiều ưu điểm so với phẩm tốt, ít phản ứng phụ, giá thành thấp HTKN dạng IgG hoặc Fab như: thời gian phù hợp với điều kiện nước ta [2, 3, 7, 9]. phân bố thuốc trong cơ thể trung bình Vi ệ c sản xuất HTKN F(ab')2 bằng enzym (3 giờ), thải trừ ra khỏi cơ thể đủ dài peps in và tủa bằng axít caprylic cũng (60 giờ), thải trừ qua mô miễn dịch, nên tương tự như quy trình sản xuất F(ab')2 không gây tổn thương thận, ái lực mô tốt sử dụng enzym pepsin và tủa ammonium và không gây hoạt hoá bổ thể [5, 8, 9]. sulfate. Với quy trình này, sản phẩm sẽ 50
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 có phản ứng phụ HTKN thấp hơn, nhưng - Hiệu lực của HTKN RHM trong đánh giá thành cao. Cần có thời gian để nghiên giá trên động vật thực nghiệm cho thấy cứu hoàn thiện cũng như kinh phí để thực hiệu giá cao 500 LD50/lọ (05 ml), trung hiện nghiên cứu nhằm đáp ứng nhu cầu hoà được 6.000 µg nọc RHM (6 mg/lọ). cấp thiết HTKN RHM trong bối cảnh hiện Điều này chứng tỏ chất lượng tốt của nay [6, 9]. nguồn nguyên liệu, khẳng định tốt quy - Sản phẩm lọ đông khô HTKN RHM trình chế tạo kháng nguyên và gây miễn lần đầu tiên thực hiện cho sản phẩm dịch. Nó cũng đã chứng minh được sự HTKN tại Việt Nam. Cần phải có nhiều hoàn thiện của quy trình tinh chế HTKN thử nghiệm về quy trình đông khô lạnh để RHM, phù hợp điều kiện kinh tế và thực tìm ra quy trình tối ưu cho việc sản xuất tế Việt Nam. Từ kết quả của nghiên cứu (thuốc phải đạt đông lạnh tốt, áp lực hút, này cho phép xây dựng các thử nghiệm thời gian đông khô...). Tỷ lệ hao hụt trong lâm sàng để đánh giá hiệu quả của HTKN quy trình đông khô lạnh 8% còn cao, cần RHM trong thời gian tới nhằm đáp ứng nghiên cứu giảm thấp hơn nữa. HTKN nhu cầu bức thiết HTKN điều trị cho BN bị dạng đông khô có nhiều ưu điểm như RHM cắn. thời gian sử dụng dài hơn, dễ bảo quản so với dạng dung dịch. Do đó, thuốc dễ KẾT LUẬN dàng phân phối đến các vùng sâu và Đã xử lý tinh chế thành công HTKN vùng xa, điều trị kịp thời cho người bị RHM đơn đặc hiệu dạng Fab’2 từ huyết RHM cắn nhằm giảm bớt tỷ lệ tử vong và tương ngựa gây miễn dịch với nọc RHM. thương tật lâu dài. Sản phẩm đáp ứng tiêu chuẩn kiểm định Quốc gia và Khuyến cáo của WHO về 2. Đánh giá huyết thanh kháng nọc độ an toàn và hiệu lực trên động vật thực RHM in vitro và in vivo. nghiệm. - Xác định được liều gây chết 50% TÀI LIỆU THAM KHẢO (LD50) của nọc RHM Việt Nam. Đây là tiền đề cho việc đánh giá hiệu lực của HTKN 1. Dược điển Việt Nam IV. Huyết thanh RHM và các nghiên cứu về nọc RHM. kháng nọc rắn, 647-648. Bộ Y tế. Nhà xuất Hiện nay, chúng ta còn ít nghiên cứu cơ bản Y học. Phụ lục XV. 2009, tr.320-325. bản về nọc RHM. Do đó, xác định được 2. Lê Khắc Quyến, Trịnh Xuân Kiếm, liều gây chết 50% của nọc RHM rất cần Hoàng Anh Tuấn. Rắn độc và chế tạo huyết thiết trong nghiên cứu độc học tại Việt Nam. thanh kháng nọc điều trị đặc hiệu tại Việt Nam. Tạp chí Y học Việt Nam. 2014, tháng 4, - Huyết thanh kháng nọc RHM đã số 2, tr.34-37. chứng minh được tính an toàn trên chuột 3. Trịnh Xuân Kiếm, Lê Khắc Quyến, lang thí nghiệm, cũng như đạt tiêu chuẩn Nguyễn Bá Phước. Nghiên cứu sản xuất huyết vô khuẩn và không có chất gây sốt. Đây thanh kháng nọc rắn hổ đất (Naja kouthia là tiêu chuẩn cần thiết của HTKN trong antivenom) ứng dụng lâm sàng. Hội thảo điều trị lâm sàng [8, 9]. Khoa học lần thứ 2, ngày 29 - 5 - 1997. 51
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Hội Hoá sinh Y Dược học, Hội Y Dược học 7. Le Khac Quyen. Clinical evaluation of TP. HCM. 1997, tr.1-23. snakebites in Vietnam: study from Choray 4. Bon, C. Serum therapy was discovered Hospital. MSc. Thesis, National University of 100 years ago. Envenomings and their treatments Singapore. 2003. (Pr°Ceedings of the first international congress, 8. Theakston RDG. An objective approach held at the Institute Pasteur, Paris, France on to antivenom therapy and assessment of first- 7-9 June 1995), Bon, C. and Goyffon, M. edited, aid measures in snake bite. Annals of Tropical Fondation Marcel Mérieux. 1996, pp.03-09. Medicine & Parasitology. 1997, Vol 91, No 7, 5. Chippaux JP. The development and use pp.857-865. of immunotherapy in Africa. Toxicon, 1998, 9. WHO. Guidelines for the production, Vol 36, No 11, pp.1503-1506. control and regulation of snake antivenom 6. Dos santos MC, Lima MRD, Furtado immunoglobulins. 2010, pp.17-40. GC, Colletto GMDD, Kipnis TL, Dias Da Silva W. Purificatio of F(ab')2 anti-snake venom by 10. Williams D, Gutierrez JM, Harrison R, caprylic acid: A fast method for obtaining IgG Warrell DA, White J, Winkle KD; fragments with high neutralization activity, Gopalakrishnakone P. The global snake bite purity and yield. Toxicon. 1989, Vol 27, No 3, initiative: an antidote for snake bite. Lancet. pp.297-303. 2010, 375, pp.89-91. 52