Kết quả ngoại kiểm chuẩn xét nghiệm đột biến gen egfr năm 2014 và 2015 tại bệnh viện Bạch Mai

Nội dung text: Kết quả ngoại kiểm chuẩn xét nghiệm đột biến gen egfr năm 2014 và 2015 tại bệnh viện Bạch Mai

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 KẾT QU Ả NGO ẠI KI ỂM CHU ẨN XÉT NGHI ỆM ĐỘT BI ẾN GEN EGFR NĂM 2014 VÀ 2015 T ẠI B ỆNH VI ỆN B ẠCH MAI Ph m C m Ph ơ ng*; Mai Tr ng Khoa*; Nguy n Ti n Lung* TÓM T ẮT Mục tiêu: chu ẩn hóa k ỹ thu ật và xác định tính chính xác c ủa xét nghi ệm đột bi ến gen EGFR bằng k ỹ thu ật Strip Assay đang th ực hi ện t ại Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu, B ệnh vi ện B ạch Mai. Ph ươ ng pháp: 29 m ẫu b ệnh ph ẩm do Mạng l ưới Ki ểm soát Ch ất l ượng Di truy ền h ọc Phân t ử châu Âu (The European Molecular Genetics Quality Network - EMQN) và H ệ th ống Ngo ại ki ểm Ch ất lượng V ươ ng qu ốc Anh (UK National External Quality Assessment Schemes - UK NEQAS) cung c ấp n ăm 2014, 2015 để xác định đột bi ến gen EGFR b ằng kít EGFR StripAssay® (ViennaLab). Các k ết qu ả này s ẽ được g ửi tr ả tr ực tuy ến và các t ổ ch ức này đánh giá, công b ố kết qu ả. Kết qu ả: cả 29 m ẫu ki ểm chu ẩn th ực hi ện đều cho k ết qu ả chính xác v ới công b ố c ủa EMQN và UK NEQAS ( đạt 100%). Kết lu ận: kỹ thu ật xét nghi ệm s ử d ụng kít EGFR StripAssay® và thi ết b ị hi ện có t ại Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu, B ệnh vi ện B ạch Mai đảm b ảo tiêu chu ẩn để phát hi ện đột bi ến gen EGFR . Các xét nghi ệm này có độ chính xác cao, ổn định, t ừ đó cung c ấp thông tin chính xác cho bác s ỹ lâm sàng ch ẩn đoán và l ập điều tr ị cho b ệnh nhân (BN) ung th ư ph ổi (UTP) không t ế bào nh ỏ. * T ừ khóa: Ung th ư ph ổi không t ế bào nh ỏ; Đột bi ến gen EGFR; Ngo ại ki ểm ki ểm tra ch ất lượng xét nghi ệm. The Results of External Quality Assessment of EGFR Mutations Testing at Bachmai Hospital Summary Objectives: To standardize the technique and assess the realibility of EGFR mutations tests by Strip Assay technique at the Gene Therapy Unit, Bachmai Hospital. Methods: 29 samples for external quality assessment which obtained from the European Molecular Genetics Quality Network (EMQN) and UK National External Quality Assessment Schemes (UK NEQAS) from 2014 to 2015 were detected EGFR mutations by EGFR StripAssay® (ViennaLab), these results were submited online and compared with validated results. Results: All of samples had same results with publication of EMQN and UK NEQAS (100% efficiency). Conclusion: EGFR mutations tests with EGFR StripAssay® kit and equipment available at the Gene Therapy Unit, Bachmai Hospital ensure the quality to detect EGFR mutations. These tests have high accuracy, providing more details for clinicians in diagnosis and treatment of non-small lung cancer management. * Key words: Non-small cell lung cancer; EGFR mutation; External quality assessment. * Bệnh vi ện B ạch Mai Ng i ph n h i (Corresponding): Ph m C m Ph ơ ng (camphuongmd@yahoo.com) Ngày nh n bài: 04/07/2016; Ngày ph n bi n đánh giá bài báo: 13/12/2016 Ngày bài báo đc đă ng: 23/12/2016 47
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 ĐẶT V ẤN ĐỀ Hi ện nay, có nhi ều ph ươ ng pháp khác nhau xét nghi m t bi n gen EGFR Ung th ư ph ổi là b ệnh ung th ư ph ổ bi ến để ệ độ ế nh ư gi ải trình t ự gen (gi ải trình t ự Sanger trên th ế gi ới và ở Vi ệt Nam. Hi ện nay, có ho ặc pyrosequencing), real time PCR nhi ều ti ến b ộ trong ch ẩn đoán (sinh h ọc (ví d ụ kít therascreen - Qiagen), lai đầu dò phân t ử, t ế bào ) và điều tr ị b ệnh UTP (Strip Assay - ViennaLab) M ỗi ph ươ ng (ph ẫu thu ật, x ạ tr ị, hóa tr ị, điều tr ị đích ), pháp đều có nh ững ưu nh ược điểm riêng: do đó đã nâng cao hi ệu qu ả điều tr ị và c ải các kít therascreen, Strip Assay có độ thi ện ch ất l ượng s ống cho ng ười b ệnh. nh ạy cao, nh ưng ch ỉ phát hi ện được s ố Một trong nh ững ti ến b ộ trong ch ẩn lượng đột bi ến gi ới h ạn theo thi ết k ế kít; đoán là xét nghi ệm đột bi ến gen EGFR trong khi các ph ươ ng pháp gi ải trình t ự có (Epidermal Growth Factor Receptor: th ụ kh ả n ăng phát hi ện đột bi ến m ới, hi ếm th ể y ếu t ố phát tri ển bi ểu mô). Gen EGFR gặp, nh ưng đòi h ỏi s ố l ượng t ế bào mang này đóng vai trò quan tr ọng trong ho ạt đột bi ến trong m ẫu phân tích l ớn [3]. Do động ch ức n ăng phát tri ển và bi ệt hóa vậy, các ph ươ ng pháp xét nghi ệm này có của t ế bào. Đột bi ến EGFR d ẫn đến t ăng th ể cho k ết qu ả khác nhau trên cùng m ột bi ểu hi ện ho ặc t ăng c ường ho ạt động c ủa mẫu phân tích. Vì v ậy, vi ệc ngo ại ki ểm tra EGFR được phát hi ện trong nhi ều lo ại ch ất l ượng xét nghi ệm có vai trò đặc bi ệt bệnh ung th ư trong đó có UTP. quan tr ọng trong đánh giá kh ả n ăng phát Hi ện nay, đã có nhi ều b ước ti ến quan hi ện đột bi ến gen EGFR . tr ọng trong điều tr ị, nh ư s ự ra đời c ủa các Nh ằm chu ẩn hóa k ỹ thu ật, đồng th ời thu ốc điều tr ị đích (kháng th ể đơ n dòng, xác định tính chính xác và tính ổn định thu ốc phân t ử nh ỏ, ức ch ế vùng tyrosine của xét nghi ệm đột bi ến gen EGFR , Đơ n kinase [tyrosine kinase inhibitor - TKI] c ủa vị Gen Tr ị li ệu, B ệnh vi ện B ạch Mai đã th ụ th ể y ếu t ố t ăng tr ưởng bi ểu mô) đã tham gia các đợt ngo ại ki ểm chu ẩn ch ất được s ử d ụng để điều tr ị cho BN UTP lượng xét nghi ệm c ủa M ạng l ưới EMQN không t ế bào nh ỏ. Các nghiên c ứu trên và H ệ th ống UK NEQAS, đều có tr ụ s ở t ại th ế gi ới và tại Vi ệt Nam đã cho th ấy BN Thành ph ố Manchester, Anh. có đột bi ến EGFR có th ời gian s ống thêm ĐỐI T ƯỢNG VÀ PH ƯƠ NG PHÁP không b ệnh ti ến tri ển (progression-free NGHIÊN C ỨU survival - PFS) và th ời gian s ống thêm toàn b ộ (overall survival - OS) cao h ơn 1. Đối t ượng nghiên c ứu. BN không có đột bi ến EGFR khi được 29 m ẫu b ệnh ph ẩm UTP không t ế bào điều tr ị b ằng các thu ốc TKI [1, 2]. Vì v ậy, nh ỏ nh ận được t ừ EMQN (10 m ẫu n ăm xét nghi ệm đột bi ến gen EGFR cho BN 2014, 10 m ẫu n ăm 2015) và UK NEQAS UTP không tế bào nh ỏ th ực s ự c ần thi ết (9 m ẫu n ăm 2015). Các m ẫu này đều để các bác s ỹ lâm sàng l ựa ch ọn ph ươ ng được c ố định b ằng formalin và đúc paraffin án điều tr ị t ối ưu nh ất cho ng ười b ệnh. (formalin-fixed, paraffin-embedded - FFPE) 48
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 để làm tiêu b ản HE và phân tích đột bi ến * Các b ước ti ến hành: 29 m ẫu b ệnh gen EGFR . Đây là các m ẫu mù, g ửi cho ph ẩm được th ực hi ện xét nghi ệm đột bi ến tất c ả các phòng thí nghi ệm đă ng ký tham EGFR theo quy trình nh ư sau: tách ADN gia ngo ại ki ểm, trong đó tình tr ạng đột từ mô FFPE (s ử d ụng kít PureLink® bi ến gen EGFR xác định tr ước đó t ừ m ột Genomic DNA Mini Kit, Hãng Invitrogen), phòng thí nghi ệm chu ẩn. định l ượng ADN (Qubit™ dsDNA HS, 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. Molecular Probes), khu ếch đại đoạn gen * Địa điểm nghiên c ứu: Đơ n v ị Gen Tr ị quan tâm b ằng ph ản ứng PCR và lai s ản li ệu, Trung tâm Y h ọc H ạt nhân và Ung ph ẩm khu ếch đại v ới đầu dò đặc hi ệu bướu - B ệnh vi ện B ạch Mai. (EGFR StripAssay®, ViennaLab), phân tích * Th ời gian nghiên c ứu: năm 2014 - kết qu ả (s ử d ụng ph ần m ềm StripAssay® 2015. Evaluator, ViennaLab). * Ph ươ ng pháp nghiên c ứu: đối chi ếu * Đối chi ếu k ết qu ả: k ết qu ả phân tích kết qu ả phân tích đột bi ến EGFR t ại B ệnh được g ửi tr ực tuy ến cho EMQN và UK vi ện B ạch Mai v ới k ết qu ả c ủa các t ổ NEQAS. Sau đó, các t ổ ch ức này s ẽ so ch ức ngo ại ki ểm. sánh k ết qu ả c ủa B ệnh vi ện B ạch Mai v ới * Thi ết b ị, v ật t ư, hóa ch ất: kết qu ả xét nghi ệm đã bi ết tr ước, t ừ đó s ẽ - Thi ết b ị: thi ết b ị c ơ b ản c ủa phòng thí phân tích, đánh giá v ề ch ất l ượng xét nghi ệm sinh h ọc phân t ử nh ư b ộ pipet nghi ệm EGFR tại Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu, kèm giá đỡ (Eppendorf Research Plus), Bệnh vi ện B ạch Mai. máy ly tâm l ạnh (Eppendorf 5424R), máy ủ nhi ệt kèm l ắc rung (Eppendorf KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU VÀ Thermomixer comfort), máy định l ượng BÀN LU ẬN ADN theo nguyên t ắc hu ỳnh quang 1. K ết qu ả ngo ại ki ểm c ủa EMQN (Qubit® 2.0 Fluorometer), máy PCR năm 2014. (Eppendorf Mastercycler pro S) Vi ệc ngo ại ki ểm tra ch ất l ượng xét - Hóa ch ất: kít tách ADN t ừ mô FFPE nghi m có vai trò c bi t quan tr ng (PureLink® Genomic DNA Mini Kit, ệ đặ ệ ọ trong ánh giá kh n ng phát hi n t Invitrogen), kít định l ượng ADN theo đ ả ă ệ độ nguyên t ắc hu ỳnh quang (Qubit™ dsDNA bi ến gen EGFR . Nh ằm chu ẩn hóa k ỹ HS, Molecular Probes), kít xác định đột thu ật, đồng th ời xác định tính chính xác bi ến gen EGFR (EGFR StripAssay®, và tính ổn định c ủa xét nghiệm đột bi ến ViennaLab) gen EGFR , Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu, B ệnh vi ện - V ật t ư tiêu hao: v ật t ư c ần thi ết được Bạch Mai đã tham gia các đợt ngo ại ki ểm các hãng uy tín cung c ấp: ống PCR; ống của hai t ổ ch ức ki ểm chu ẩn ch ất l ượng ly tâm 1,7 ml; đầu tip 10, 20, 200, 1.000 µl xét nghi ệm uy tin trên th ế gi ới: EMQN (t ừ (Corning); ống Qubit assay (Invitrogen) năm 2014) và UK NEQAS (t ừ n ăm 2015). 49
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 Bảng 1: K ết qu ả phân tích đột bi ến gen EGFR trên các m ẫu ki ểm chu ẩn EMQN 2014. Kết qu ả phân tích Mã b ệnh Vị trí/ph ươ ng pháp Kết qu ả c ủa Ch ẩn đoán ph ẩm lấy m ẫu EMQN tại Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu UTP (bi u mô U thùy trên ph i ph i Không phát hi n Không phát hi n 01.6127774 ể ổ ả ệ ệ tuy ến) (ph ẫu thu ật) đột bi ến đột bi ến UTP (bi ểu mô Đột bi ến L858R Đột bi ến L858R 02.6130768 Ph ế qu ản (sinh thi ết) tuy ến) (exon 21) (exon 21) UTP (bi u mô U thùy trên ph i ph i t bi n G719S t bi n G719S 03.6153218 ể ổ ả Độ ế Độ ế tuy ến) (ph ẫu thu ật) (exon 18) (exon 18) EMQN không EMQN không cung Không phát hi n Không phát hi n 04.6126965 ệ ệ cung c ấp cấp đột bi ến đột bi ến EMQN không EMQN không cung Không phát hi n Không phát hi n 05.6127265 ệ ệ cung c ấp cấp đột bi ến đột bi ến EMQN không Không phát hi ện Không phát hi ện 06.6130038 EMQN khôngcung c ấp cung c ấp đột bi ến đột bi ến t bi n t bi n EMQN không EMQN không cung Độ ế Độ ế 07.6130241 E746_A750del E746_A750del cung c p c p ấ ấ (exon 19) (exon 19) EMQN không EMQN không cung t bi n L861Q t bi n L861Q 08.6126384 Độ ế Độ ế cung c ấp cấp (exon 21) (exon 21) EMQN không EMQN không cung t bi n L858R t bi n L858R 09.6161625 Độ ế Độ ế cung c ấp cấp (exon 21) (exon 21) t bi n t bi n EMQN không EMQN không cung Độ ế Độ ế 10.6161844 E746_A750del E746_A750del cung c p c p ấ ấ (exon 19) (exon 19) Gen EGFR n ằm ở nhi ễm s ắc th ể 7p11.2, Chúng tôi s ử d ụng kít EGFR StripAssay® dài kho ảng 200 kb, ch ứa 28 exon. Các đột (ViennaLab) để phân tích đột bi ến gen bi ến liên quan đến đáp ứng v ới TKI n ằm EGFR . Đây là kít được thi ết k ế theo trên các exon t ừ 18 - 21, trong đó các đột nguyên t ắc PCR k ết h ợp lai đầu dò đặc bi ến thay th ế ở exon 18 và 21, m ất đoạn hi ệu: giai đoạn PCR s ử d ụng m ồi (primer) ở exon 19 (chi ếm ch ủ y ếu) làm t ăng độ đặc hi ệu giúp khu ếch đại chính xác v ới nh ạy v ới thu ốc, đột bi ến thay th ế T790M các trình t ự gen quan tâm. Phân t ử biotin và m ột s ố đột bi ến thêm đoạn trên exon được g ắn trên m ồi nh ờ đó c ũng đưa vào 20 (chi ếm t ỷ l ệ nh ỏ) liên quan đến kháng sản ph ẩm khu ếch đại. Ở giai đoạn lai, thu ốc. T ỷ l ệ đột bi ến EGFR ph ụ thu ộc vào nh ững đoạn ADN được khu ếch đại k ết ch ủng t ộc, tình tr ạng hút thu ốc lá, gi ới , hợp chính xác v ới đầu dò (probe) t ươ ng tỷ l ệ đột bi ến EGFR ở ng ười ch ủng t ộc ứng trên teststrip, phân t ử biotin g ắn châu Á cao h ơn ch ủng t ộc châu Âu, châu trên nh ững đoạn này được ho ạt hoá Mỹ [2, 4]. bởi streptavidin thành d ạng phát màu. 50
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 Nh ờ đó, d ễ dàng phát hi ện k ết qu ả b ằng StripAssay® có kh ả n ăng phát hi ện cách so màu trên teststrip, đối chi ếu v ới 16 đột bi ến, chi ếm t ỷ l ệ cao nh ất trên thang chu ẩn b ằng m ắt th ường ho ặc exon 18 - 21 và có vai trò trong đáp ứng ph ần m ềm StripAssay® Evaluator. Bộ kít điều tr ị v ới TKI. Hi ện nay, chúng tôi có độ nh ạy cao, có kh ả n ăng phát hi ện đã chuy ển sang s ử d ụng kít EGFR XL khi s ố l ượng t ế bào mang đột bi ến < 1%, StripAssay® được c ải ti ến t ừ kít EGFR đồng th ời được c ấp ch ứng ch ỉ tiêu StripAssay®, trong đó s ố l ượng đột bi ến chu ẩn xét nghi ệm châu Âu áp dụng cho phát hi ện cao h ơn (30 đột bi ến trên các ch ẩn đoán b ệnh (European Conformity - exon 18 - 21) để nâng cao h ơn ch ất l ượng In Vitro Diagnostics, CE-IVD). Kít EGFR xét nghi ệm. Kết qu ả phân tích đột bi ến gen EGFR trên 10 m ẫu ki ểm chu ẩn t ại Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu đều cho k ết qu ả chính xác theo công b ố c ủa EMQN 2014, đạt t ỷ l ệ 100%. Hình 1: Phân tích k ết qu ả trên thanh teststrip. (Trên m ỗi thanh teststrip có s ẵn v ạch control cho ph ản ứng lai, PCR negative control cho t ừng exon [v ạch 17 - 20] và PCR positive control (v ạch 21) làm đối ch ứng. Các v ạch 1 - 16 t ươ ng ứng v ới 16 đột bi ến trên 4 exon 18 - 21. M ẫu 01.6127774 [trái] không phát hi ện đột bi ến, m ẫu 02.6130768 [gi ữa] phát hi ện đột bi ến L858R trên exon 21, mẫu 03.6153218 [ph ải] phát hi ện đột bi ến G719S trên exon 18) 51
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 2. K ết qu ả ngo ại ki ểm c ủa EMQN n ăm 2015. Bảng 2: So sánh k ết qu ả phân tích đột bi ến gen EGFR trên các m ẫu ki ểm chu ẩn EMQN 2015. Mã Vị trí/ph ươ ng Kết qu ả phân tích Ch ẩn đoán Kết qu ả c ủa EMQN bệnh ph ẩm pháp l ấy m ẫu tại Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu UTP Ph ế qu ản Không phát hi ện Không phát hi ện 01.6270600 (bi ểu mô tuy ến) (sinh thi ết) đột bi ến đột bi ến UTP U thùy trên ph ổi Đột bi ến L861Q Đột bi ến L861Q 02.6266929 (bi ểu mô tuy ến) ph ải (ph ẫu thu ật) (exon 21) (exon 21) UTP U thùy trên ph ổi Đột bi ến T790M Đột bi ến T790M 03.6270088 (bi ểu mô tuy ến) ph ải (ph ẫu thu ật) (exon 20) (exon 20) EMQN không EMQN không Không phát hi ện Không phát hi ện 04.6271000 cung c ấp cung c ấp đột bi ến đột bi ến EMQN không EMQN không Đột bi ến L858R Đột bi ến L858R 05.6267553 cung c ấp cung c ấp (exon 21) (exon 21) EMQN không EMQN không Không phát hi ện Không phát hi ện 06.6271489 cung c ấp cung c ấp đột bi ến đột bi ến EMQN không EMQN không Đột bi ến L858R (exon 21) Đột bi ến L858R (exon 21) 07.6266391 cung c ấp cung c ấp và T790M (exon 20) và T790M (exon 20) EMQN không EMQN không Không phát hi ện Không phát hi ện 08.6271739 cung c ấp cung c ấp đột bi ến đột bi ến Đột bi ến EMQN không EMQN không Đột bi ến E746_S752del- 09.6290622 E746_S752del-insV cung c ấp cung c ấp insV (exon 19) (exon 19) EMQN không EMQN không Đột bi ến E746_A750del Đột bi ến E746_A750del 10.6291042 cung c ấp cung c ấp (exon 19) (exon 19) Tươ ng t ự EMQN 2014, k ết qu ả phân tích đột bi ến gen EGFR trên 10 m ẫu ki ểm chu ẩn EMQN 2015 t ại Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu đều cho k ết qu ả chính xác theo công b ố, đạt t ỷ l ệ 100%. 52
7. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 3. K ết qu ả ngo ại ki ểm c ủa UK NEQAS n ăm 2015. Bảng 3: K ết qu ả phân tích đột bi ến gen EGFR trên các m ẫu ki ểm chu ẩn UK NEQAS 2015. Mã b ệnh Vị trí/ph ươ ng Kết qu ả phân tích Ch ẩn đoán Kết qu ả c ủa UK NEQAS ph ẩm pháp l ấy m ẫu tại Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu UTP (bi u mô U ph ổi Không phát hi n Không phát hi n 172L14A ể ệ ệ tuy ến) (ph ẫu thu ật) đột bi ến đột bi ến t bi n t bi n UTP (bi u mô U thùy d i ph i Độ ế Độ ế 182L14E ể ướ ổ L747_P753delinsS (exon L747_P753delinsS tuy n) ph i (ph u thu t) ế ả ẫ ậ 19) (exon 19) Đột bi ến UTP (bi u mô Kh i di c n bu ng G746_P753delinsVS t bi n T790M 192L15D ể ố ă ồ Độ ế tuy ến) tr ứng (ph ẫu thu ật) (exon 19) và T790M (exon 20) (exon 20) UTP (bi ểu mô U ph ổi Không phát hi n Không phát hi n 210L15C ệ ệ tuy ến) (ph ẫu thu ật) đột bi ến đột bi ến UTP (bi u mô U thùy trên ph i Không phát hi n Không phát hi n 211L15C ể ổ ệ ệ tuy ến) ph ải (ph ẫu thu ật) đột bi ến đột bi ến UTP (bi ểu mô U thùy d i ph i Đột bi ến (S768_D770 Không phát hi n 233L15C ướ ổ ệ tuy ến) trái (ph ẫu thu ật) dup) (;) (P772A) (exon 20) đột bi ến UTP (bi u mô U thùy d i ph i Không phát hi n Không phát hi n 220L15C ể ướ ổ ệ ệ tuy ến) ph ải (ph ẫu thu ật) đột bi ến đột bi ến UTP (bi ểu mô U ph ổi Không phát hi n Không phát hi n 219L15C ệ ệ tuy ến) (ph ẫu thu ật) đột bi ến đột bi ến UTP (bi u mô U thùy d i ph i Không phát hi n Không phát hi n 245L15C ể ướ ổ ệ ệ tuy ến) trái (ph ẫu thu ật) đột bi ến đột bi ến Kết qu ả phân tích đột bi ến gen EGFR Tr ị li ệu cho k ết qu ả chính xác 100% theo trên 9 m ẫu ki ểm chu ẩn UK NEQAS 2015 công b ố c ủa EMQN. Đây là k ết qu ả r ất tại Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu cho k ết qu ả chính đáng khích l ệ khi so sánh v ới k ết qu ả xác 7/9 m ẫu. Đối v ới 2 tr ường h ợp m ẫu tổng h ợp c ủa EMQN, t ỷ l ệ xét nghi ệm l ỗi 192L15D và 233L15C, UK NEQAS xác của các phòng thí nghi ệm tham gia ngo ại ki ểm n ăm 2014 là 3,8%, n ăm 2015 là 4,2%, nh ận k ết qu ả phân tích t ại Đơ n v ị Gen Tr ị nh ưng t ỷ l ệ này ở Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu là li ệu không phát hi ện được các đột bi ến 0% trong c ả 2 n ăm. Nh ững v ấn đề sai sót hi ếm g ặp do h ạn ch ế c ủa kít xét nghi ệm, xảy ra ở các labo có th ể do tr ường h ợp do đó v ẫn đánh giá độ chính xác 100% v ề đột bi ến hi ếm g ặp nh ư G719S trên exon ch ất l ượng labo. 18, E746_S752delinsV trên exon 19 hay Kết qu ả ngo ại ki ểm theo EMQN trong L861Q trên exon 21 ( được khuy ến cáo năm 2014 và 2015 cho th ấy Đơ n v ị Gen không phát hi ện b ằng kít cobas); ho ặc m ẫu 53
8. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 có t ỷ l ệ t ế bào mang đột bi ến th ấp (nh ư m ẫu các ph ươ ng pháp ho ặc kít xét nghi ệm có 2, 3 và 7 c ủa EMQN 2014 có t ỷ l ệ này độ nh ạy không cao, đặc bi ệt là ph ươ ng < 15%), gây nên âm tính gi ả khi s ử dụng pháp gi ải trình t ự gen [5, 6]. Bảng 4: Tổng h ợp xét nghi ệm l ỗi c ủa các labo tham gia ki ểm chu ẩn EMQN năm 2014 và 2015. EMQN 2014 EMQN 2015 Số labo Số labo xét Tỷ l ệ l ỗi Số labo g ửi Số labo xét Tỷ l ệ l ỗi Mẫu Mẫu gửi k ết qu ả nghi ệm l ỗi (%) kết qu ả nghi ệm l ỗi (%) 1 254 3 1,1 1 279 9 3,2 2 254 9 4,3 2 279 21 11,1 3 256 11 5,4 3 279 16 7,5 4 252 8 3,2 4 282 7 2,9 5 253 6 2,4 5 282 13 4,6 6 256 9 3,5 6 282 8 2,8 7 249 6 2,3 7 282 11 3,9 8 256 22 8,5 8 282 8 2,8 9 249 10 4,0 9 282 10 3,6 10 256 9 3,5 10 282 22 7,8 Tổng 2543 93 3,8 Tổng 2.811 117 4,2 (N ăm 2014 có 277 labo ở 39 qu ốc gia đang ký tham gia, trong đó 258 labo hoàn thành và báo cáo k ết qu ả. N ăm 2015 có 290 labo báo cáo k ết qu ả trong t ổng s ố 321 labo [ ở 47 qu ốc gia] đă ng ký tham gia). Đối v ới k ết qu ả ngo ại ki ểm theo UK hi ện được b ằng kít EGFR XL StripAssay® NEQAS 2015, Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu th ực mà chúng tôi đang s ử d ụng hi ện nay. hi ện trên 9 m ẫu b ệnh ph ẩm, cho k ết qu ả Trong khi đó, m ẫu 233 mang đồng th ời 2 chính xác 7/9 m ẫu. Đối v ới m ẫu 192, khi đột bi ến hi ếm g ặp trên exon 20: đột bi ến sử d ụng kít EGFR StripAssay®, chúng tôi thêm đoạn S768_D770 (0,02%) và đột ch ỉ phát hi ện đột bi ến T790M trên exon 20, bi ến thay th ế P772A (< 0,01%), đều là th ực t ế m ẫu này có thêm đột bi ến nh ững d ạng không phát hi ện được b ằng G746_P753delinsVS trên exon 19 ( đây là kít EGFR StripAssay®. Trong c ả 2 tr ường đột bi ến r ất hi ếm g ặp, theo c ơ s ở d ữ li ệu hợp này, UK NEQAS đều xác nh ận do COSMIC phân tích trên 141.465 b ệnh hạn ch ế c ủa kít xét nghi ệm và v ẫn đánh nhân, đột bi ến này ch ỉ chi ếm 0,02% t ổng giá độ chính xác 100% v ề ch ất l ượng labo số đột bi ến). Đột bi ến này có th ể phát [7, 8]. 54
9. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 Bảng 5: Tổng h ợp xét nghi ệm l ỗi c ủa các labo tham gia ki ểm chu ẩn UK NEQAS năm 2015. STT Mẫu Số labo g ửi k ết qu ả Số labo xét nghi ệm l ỗi Tỷ l ệ l ỗi (%) 1 172 100 7 7,0 2 182 100 5 5,0 3 192 100 11 11,0 4 210 100 2 2,0 5 211 100 1 1,0 6 233 100 20 20,0 7 220 100 2 2,0 8 219 100 5 5,0 9 245 100 2 2,0 Tổng s ố 900 55 6,1 (Có 100 labo báo cáo k ết qu ả trong t ổng s ố 105 labo đă ng ký tham gia). Hi ện nay, có nhi ều ph ươ ng pháp khác mang đột bi ến trong m ẫu phân tích l ớn, nhau để xét nghi ệm đột bi ến gen EGFR đồng th ời k ết qu ả xét nghi ệm ph ụ thu ộc nh ư gi ải trình t ự gen (gi ải trình t ự Sanger nhi ều vào k ỹ thu ật viên (thi ết k ế m ồi, thao ho ặc pyrosequencing), real time PCR tác th ực hi ện, nh ận định k ết qu ả) [3]. (ví d ụ nh ư kít therascreen - Qiagen, cobas - Th ực t ế qua k ết qu ả t ổng k ết c ủa 3 đợt Roche), lai đầu dò (Strip Assay - ngo ại ki ểm cho th ấy: m ột s ố d ạng đột ViennaLab) M ỗi ph ươ ng pháp đều có bi ến hi ếm g ặp không phát hi ện được nh ững ưu nh ược điểm riêng: kít therascreen, bằng các kít th ươ ng m ại nh ư L861Q trên cobas, Strip Assay có độ nh ạy cao, có exon 21 (không phát hi ện được b ằng kít ch ứng ch ỉ IVD, nh ưng ch ỉ phát hi ện được cobas - Roche), thêm đoạn exon 20 ( đối số l ượng đột bi ến gi ới h ạn theo thi ết k ế với kít therascreen - Qiagen, Strip Assay - kít (th ường là các d ạng đột bi ến ph ổ bi ến, ViennaLab); các ph ươ ng pháp gi ải trình với t ổng t ỷ l ệ xu ất hi ện chi ếm > 95%); tự gen cho k ết qu ả âm tính gi ả đối v ới trong khi các ph ươ ng pháp gi ải trình t ự có mẫu có t ỷ l ệ t ế bào mang đột bi ến th ấp, kh ả n ăng phát hi ện được đột bi ến m ới, ngoài ra ch ất l ượng xét nghi ệm không hi ếm g ặp, nh ưng đòi h ỏi s ố l ượng t ế bào ổn định [5, 6, 7, 8]. 55
10. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017 Bảng 6: Ưu, nh ược điểm c ủa m ột s ố ph ươ ng pháp phát hi ện độ t bi ến gen EGFR [3]. Gi ải trình t ự Ph ươ ng pháp Gi ải trình t ự Sanger Therascreen Strip Assay pyrosequencing Ch ứng ch ỉ CE - IVD Không Không Có Có Gi ới h ạn phát hi ện 25 - 30% 5 - 10% 1% < 1% Th ời gian tr ả k ết qu ả 2 - 3 ngày 2 ngày 1/2 ngày 1 ngày Th ời gian th ực hi ện 6 gi ờ 4 gi ờ 2 gi ờ 6 gi ờ Số xét nghi ệm t ối thi ểu 1 ph ản ứng 1 ph ản ứng 8 ph ản ứng 1 ph ản ứng mỗi l ần ch ạy Kh n ng phát hi n t ả ă ệ độ Có Có Không Không bi ến hi ếm g ặp Thi ết b ị chuyên d ụng Hệ th ống Hệ th ống Hệ th ống real Hệ th ống cần thi ết gi ải trình t ự Sanger pyrosequencing time PCR PCR KẾT LU ẬN Li c m ơn: Nhóm nghiên c ứu xin chân thành c ảm ơn Công ty Roche và Qua nghiên c ứu 29 m ẫu b ệnh ph ẩm AstraZeneca đã h ỗ tr ợ đă ng ký tham gia UTP không t ế bào nh ỏ th ực hi ện ngo ại ki m chu n xét nghi m t bi n gen ki ểm xét nghi ệm EGFR t ại Đơ n v ị Gen Tr ị ể ẩ ệ độ ế EGFR . li ệu, B ệnh vi ện B ạch Mai n ăm 2014 - 2015 cho th ấy: TÀI LI ỆU THAM KH ẢO - K thu t xét nghi m s d ng kít ỹ ậ ệ ử ụ 1. Tạ Thành V ăn. Nghiên c ứu xác định đột EGFR StripAssay® và các thiết b ị hi ện có bi ến gen quy ết định tính đáp ứng thu ốc trong tại Đơ n v ị Gen Tr ị li ệu, B ệnh vi ện B ạch điều tr ị ung th ư đại tr ực tràng và UTP. Đề tài Mai đảm b ảo tiêu chu ẩn để phát hi ện đột Khoa h ọc c ấp Nhà n ước KC.04.06/11-15. B ộ bi ến gen EGFR . Khoa h ọc và Công ngh ệ. 2014. - 27/29 m ẫu ngo ại ki ểm cho k ết qu ả 2. Shi Y, Au J.S, Thongprasert S, Srinivasan S, Tsai CM, Khoa M. T et al. A chính xác, 2 m ẫu còn l ại mang các đột prospective, molecular epidemiology study of bi ến r ất hi ếm g ặp và không có trong thi ết EGFR mutations in Asian patients with advanced kế c ủa b ộ kít, do đó v ẫn được các t ổ non-small-cell lung cancer of adenocarcinoma ch ức ngo ại ki ểm đánh giá labo Đơ n v ị histology (PIONEER). J Thorac Oncol. 2014, Gen Tr ị li ệu cho k ết qu ả chính xác 100%. 9 (2), pp.154-162. Nh ư v ậy, xét nghi ệm đột bi ến gen 3. Jancik S, Drabek J et al. A comparison EGFR th ực hi ện t ại B ệnh vi ện B ạch Mai of direct sequencing, pyrosequencing, high resolution melting analysis, TheraScreen DxS, có độ chính xác và ổn định cao. T ừ đó, and the K-ras Strip Assay for detecting KRAS cung c ấp thêm thông tin đáng tin c ậy cho mutations in non small cell lung carcinomas. bác s ỹ lâm sàng trong điều tr ị UTP không Journal of Experimental & Clinical Cancer tế bào nh ỏ. Research. 2012, 31, pp.79-91. 56