Kết quả bước đầu ứng dụng quy trình chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi bệnh β - thalassemia bằng kỹ thuật minisequencing

Nội dung text: Kết quả bước đầu ứng dụng quy trình chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi bệnh β - thalassemia bằng kỹ thuật minisequencing

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 KẾT QU Ả B ƯỚC ĐẦU ỨNG D ỤNG QUY TRÌNH CH ẨN ĐOÁN DI TRUY ỀN TR ƯỚC CHUY ỂN PHÔI B ỆNH β-THALASSEMIA BẰNG K Ỹ THU ẬT MINISEQUENCING Ngô Tr ường Giang*; Nguy ễn Đình T ảo*; Tr ần V ăn Khoa* Qu ản Hoàng Lâm*; Tri ệu Ti ến Sang*; Nguy ễn Thanh Tùng* TÓM T ẮT Hai v ợ ch ồng mang gen b ệnh di truy ền đơ n gen luôn ti ềm ẩn nguy c ơ sinh con m ắc b ệnh, vi ệc nghiên c ứu ứng d ụng quy trình ch ẩn đoán di truy ền tr ước chuy ển phôi là h ết s ức c ần thi ết và có ý ngh ĩa nhân v ăn. Đối t ượng và ph ươ ng pháp : nghiên c ứu th ực hi ện trên 6 c ặp gia đình mang gen đột bi ến gây b ệnh β-thalassemia t ại H ọc vi ện Quân y t ừ tháng 2 - 2015 đến 12 - 2015. Máu ngo ại vi b ố, m ẹ được tách ADN, sinh thi ết 1 - 2 t ế bào t ừ phôi th ụ tinh trong ống nghi ệm phát tri ển đến ngày 3 ho ặc ngày 5 c ủa các c ặp gia đình này, nhân toàn b ộ gen các m ẫu phôi sinh thi ết, phát hi ện đột bi ến gây b ệnh trên máu b ố m ẹ và phôi đồng th ời b ằng 2 ph ươ ng pháp minisequencing và StripAssay. Kết qu ả: s ản ph ẩm nhân WGA rõ, ADN t ập trung t ạo v ạch rõ ở vùng 30 kb. Trên hình ảnh Tripassay, c ăn c ứ các v ạch xu ất hi ện có th ể xác định phôi bình th ường hay bi ểu hi ện b ệnh. Kết lu ận: b ằng k ỹ thu ật minisequencing and StripAssay đã ch ọn được các phôi không bị b ệnh để chuy ển vào t ử cung ng ười m ẹ. * T ừ khóa: B ệnh β-thalassemia; T ế bào phôi; Ch ẩn đoán tr ước chuy ển phôi; K ỹ thu ật minisequencing. Initial Results of Using Preimplantation Genetic Diagnosis for β-Thalassemia by Minisequencing Technique Summary A couple carrying single gene disorder had baby with birth defect. The research and application of genetic diagnostic procedures before embryo transfer is essential and meaningful humanities. Subjects and methods: Study on application of preimplantation genetic diagnosis method for β- thalassemia disease in Military Medical University from 2 - 2015 to 12 - 2015. The study was carried out on 6 couples who were β-thalassemia carriers. DNA of β-thalassemia carriers were isolated from whole blood. One blastomere or trophectoderm was biopsied from day 3 or day 5 embryos after IVF-ICSI, then embryo whole genome was amplified. Results: The product of WGA is clear, DNA outlined in the 30 kb region. On the photographs of Tripassay that appear normal embryo or disease manifestation. Conclusion: Minisequencing and StripAssay, which were parallely performed can detect unaffected mutations embryos for uterus transfer. * Key words: Beta-thalassemia; Blastomere; Preimplantation genetic diagnosis; Minisequencing technique. * Học vi ện Quân y Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Ngô Tr ường Giang (dungtu86@yahoo.com) Ngày nh ận bài: 03/06/2016; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 17/07/2016 Ngày bài báo được đă ng: 22/07/2016 23
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 ĐẶT V ẤN ĐỀ Các đột bi ến gen beta-globin gây b ệnh β-thalassemia là m ột trong nh ững b ệnh β-thalassemia th ường là đột bi ến điểm. di truy ền đơ n gen ph ổ bi ến nh ất trên Nghiên c ứu g ần đây nh ất c ủa Lý Th ị th ế gi ới [1, 9]. Ở Vi ệt Nam, ước tính có Thanh Hà và CS (2008) khi áp d ụng k ỹ kho ảng 5 tri ệu ng ười mang gen và b ị thu ật ARMS - PCR trong ch ẩn đoán tr ước bệnh. Hàng n ăm có kho ảng 2.000 tr ẻ sinh và sau sinh t ại B ệnh vi ện Nhi Trung ươ ng ra m ắc b ệnh thalassemia. cho kết qu ả: Tên đột bi ến CD17 CD41/42 -28M IVS1-1 IVS1-5 CD71/72 IVS2654 HBE L.T.Hà và CS 41,6 34,7 2,8 1,4 2,8 5,6 0 12,5 Saovaros và CS 20,5 35,3 7,3 6 0 7,3 7,3 31 Điều tr ị cho nh ững BN này t ạo m ột gánh đột bi ến gen gây b ệnh β-thalassemia đã nặng c ả v ề kinh t ế c ũng nh ư tinh th ần cho sinh con b ị b ệnh và có nguy ện v ọng sinh gia đình và toàn xã h ội. Chính vì v ậy, vi ệc con kh ỏe m ạnh t ại H ọc vi ện Quân y nh ằm phòng b ệnh và kh ống ch ế phát tán b ệnh đánh giá k ết qu ả ban đầu ứng d ụng quy ra c ộng đồng là r ất c ấp thi ết. trình ch ẩn đoán di truy ền tr ước chuy ển Hi ện nay, m ột s ố bi ện pháp can thi ệp phôi b ệnh β-thalassemia. ch ẩn đoán tr ước sinh được áp d ụng nh ư ĐỐI T ƯỢNG, HÓA CH ẤT VÀ ch ọc hút n ước ối hay sinh thi ết gai rau đã PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN C ỨU ph ần nào h ạn ch ế sinh ra nh ững tr ẻ b ị b ệnh. 1. Đối t ượng nghiên c ứu. Tuy nhiên, nh ững ph ươ ng pháp này ti ến 12 m ẫu máu c ủa 6 gia đình g ồm b ố, hành khá mu ộn, n ếu d ừng thai k ỳ s ẽ ảnh mẹ mang gen β-thalassemia, có con b ị hưởng r ất l ớn t ới s ức kh ỏe thai ph ụ. bệnh β-thalassemia, có k ết qu ả sàng l ọc Ch ẩn đoán di truy ền tr ước chuy ển phôi đột bi ến β-thalassemia t ừ ADN máu toàn (Preimplantation Genetic Diagnosis-PGD) ph ần (s ử d ụng làm đối ch ứng), 26 m ẫu là ph ươ ng pháp sàng l ọc phôi b ất th ường phôi sinh thi ết t ừ các phôi th ụ tinh trong về m ặt di truy ền được th ực hi ện tr ước khi ống nghi ệm phát tri ển đến ngày 3 c ủa cấy phôi vào t ử cung ng ười m ẹ. Đây là m ột 6 gia đình này. L ấy 5 ml máu b ố, m ẹ cho ph ươ ng pháp d ự phòng hi ệu qu ả cho các vào ống ch ống đông b ằng EDTA, phôi bệnh di truy ền, trong đó có β-thalassemia ngày 3 sinh thi ết 1 - 2 t ế bào, r ửa nhi ều [4, 5, 7, 8]. lần b ằng PBS1X đặt trong ống 0,2 ml. Sau khi xây d ựng được quy trình ch ẩn 2. Hóa ch ất và thi ết b ị. đoán di truy ền tr ước chuy ển phôi b ệnh * Hóa ch ất: WGA REPLI-g Single Cell β-thalassemia, chúng tôi b ước đầu ứng Kit, β-Globin StripAssay SEA kit (Vienna dụng vào ch ẩn đoán di truy ền tr ước chuy ển Lab), SAP, EXO1, Hidi-formamid; Gene- phôi cho các gia đình có b ố m ẹ mang gen Scan-120 LIZ, PCR Reaction mix, DNA 24
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 Polymerase, primers, minisequensing 20 l ần. Ti ến hành ph ản ứng nested-PCR primers, SNaPshot Multiplex Kit. theo Wang và CS (2003) có c ải biên [3]. * Thi ết b ị: máy ly tâm v ăng, kính hi ển Cụ th ể: nhân gen β-globin v ới th ể tích 50 μl vi soi n ổi 32X, bu ồng thao tác PCR (M ỹ), ch ứa s ản ph ẩm nhân toàn b ộ gen pha máy PCR ABI 9700 (Applied biosystem), loãng; 0,2 μM m ỗi primer vòng 1; 0,2 mM hốt ủ hóa ch ất (Hàn Qu ốc), máy điện di t ự mỗi lo ại deoxyribonucleotide triphosphate động 3130xl Genetic analyzer, h ệ th ống (dNTP) và 2,5 đơ n v ị HotStarTaq DNA điện di trên gel. Polymerase (Qiagen) trong 1X PCR buffer ch ứa 1,5 mM MgCl2, tiến hành minisequencing 3. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. với SNaPshotTM multiplex ready reaction Tách ADN t ừ máu toàn ph ần c ủa b ố m ẹ. mix (Applied Biosystems) và 0,2 μM m ỗi Nhân toàn b ộ gen các m ẫu phôi sinh thi ết, minisequencing primer theo quy trình c ủa ki ểm tra s ản ph ẩm b ằng điện di, pha loãng nhà s ản xu ất. Bảng 1: Trình t ự m ồi gen β-globin. Kích th ước Tên m ồi Trình t ự m ồi 5’-3’ Vị trí g ắn trên gen đích sản ph ẩm BGLO-F GTCATCACTTAGACCTCACC HUMHBB: 62.016 - 62.035 1.409 bp BGLO-R CAGAATAATCCAGCCTTATCC HUMHBB: 63.424 - 63.404 Bảng 2: Chu trình nhi ệt ph ản ứng PCR nested-PCR. 95 0C 15 phút 1 chu k ỳ 95 0C 45 giây 56 0C 45 giây 30 chu k ỳ 72 0C 2 phút 72 0C 5 phút 1 chu k ỳ Sản ph ẩm nhân vòng 2 được tinh s ạch b ằng 2 enzym SAP và EXO1, ch ạy multiplex minisequensing theo quy trình kít ABI PRIMERSNaPshot Multiplex (Applied Biosystems) với các m ồi minisequencing. Bảng 3: Trình t ự các m ồi s ử d ụng cho minisequencing. SNP-41/42 CCTTGGACCCAGAGGTT SNP-654 TGATAATTTCTGGGTTAAGG SNP-28 (gact) 7 GATGGCTCTGCCCTGACTT Cd 26 (gact)3 CAACCTGCCCAGGGCCT Cd 17R act (gact)7 CAACTTCATCCACGTTCACCT Cd 28R (gact)6 GATGGCTCTGCCCTGACTT Cd 71/72F ct (gact)8 AGAAAGTGCTCGGTGCCTTTA IVSI-1R TCTTGTAACCTTGATACCAA 25
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 Sản ph ẩm minisequencing được điện nhi ều v ật li ệu di truy ền để ph ối h ợp các di hu ỳnh quang trên máy 3130xl Genetic ph ươ ng pháp ch ẩn đoán khác, t ừ đó làm analyzer, phân tích b ằng ph ần m ềm tăng độ chính xác và tính ổn định c ủa GeneMapper ID v 3.2. Đánh giá k ết qu ả ch ẩn đoán. phát hi ện đột bi ến d ựa vào kích th ước, 2. K ết qu ả nhân gen β-globin và ki ểm màu s ắc và độ l ớn c ủa píc thu được trên tra đột bi ến b ằng bộ kít TripAssay. điện di hu ỳnh quang. Ti ến hành sàng l ọc b ố, mẹ và các m ẫu phôi b ằng c ả minisequencing và StripAssay. KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU VÀ BÀN LU ẬN 1. K ết qu ả nhân toàn b ộ gen. Nguyên lý c ủa ph ươ ng pháp này là primer m ở r ộng tr ước khi khu ếch đại b ằng cách s ử d ụng m ột h ỗn h ợp ng ẫu nhiên c ủa oligonucleotides 15 bp khu ếch đại toàn b ộ gen c ủa m ột t ế bào t ạo ra các đoạn ADN có kích th ước 2 - 70 kb. Hình 2: Hình ảnh điện di trên gel agarose sản ph ẩm khu ếch đại gen β-globin. Marker ADN 1 kp (d ải gi ữa); ch ứng âm (-); ch ứng d ươ ng (+); P1, P2, P3, P4, P5, P6: mẫu phôi, THB 24; THC: m ẫu b ố và m ẫu mẹ gia đình 24. Hình 1: Hình ảnh điện di ki ểm tra s ản ph ẩm sau nhân WGA. (Marker ADN 1 kp; P1-6: 6 phôi c ủa gia đình 24). Hình 1 cho th ấy s ản ph ẩm nhân WGA rõ, ADN t ập trung t ạo v ạch rõ ở vùng 30 kb, phù h ợp v ới khuy ến cáo c ủa nhà s ản xu ất. Sau khi ki ểm tra s ản ph ẩm b ằng điện di agarose, ti ến hành pha loãng s ản ph ẩm 20 l ần b ằng n ước deion. Nh ư v ậy, Hình 3: Hình ảnh ch ẩn đoán 6 phôi kỹ thu ật nhân toàn b ộ gen đã giúp có sinh thi ết b ằng kí t TripAssay gia đình 24. 26
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 Hình 2 cho th ấy s ản ph ẩm nhân gen có ch ất l ượng t ốt, kích th ước phù h ợp v ới dự ki ến theo thi ết k ế, b ăng điện di rõ, nét, đẹp, không th ấy s ản ph ẩm ph ụ. Hình 3 là ảnh TripAssay ch ẩn đoán 6 phôi sinh thi ết ngày 5 c ủa gia đình s ố 24. Trong 6 phôi này, 2 phôi mang gen đồng hợp t ử Cd17, đó là phôi s ố 2 và s ố 3. Các phôi này khi lai TripAssay th ấy xu ất hi ện vạch t ại v ị trí đột bi ến Cd17 và m ất c ả vạch t ại v ị trí bình thường c ủa Cd17. Phôi số 1 không xu ất hi ện v ạch đột bi ến (bình th ường). Phôi s ố 4, 5, 6 xu ất hi ện v ạch đột bi ến, nh ưng ch ưa m ất v ạch ở v ị trí Hình 5: Hình ảnh điện di minisequenicng bình th ường nên các phôi này ch ỉ mang 6 phôi c ủa gia đình 24. gen d ị h ợp t ử Cd17, sau này s ẽ không bi ểu hi ện b ệnh. Ở hình 4, m ẫu tr ường h ợp b ố 24, tr ường 3. K ết qu ả phát hi ện đột bi ến trên các hợp m ẹ 24 mang ki ểu gen d ị h ợp t ử Cd17, phôi th ụ tinh trong ống nghi ệm. đỉnh trái xanh lá cây là nucleotid A ( đột bi ến), Chúng tôi ti ến hành đồng th ời hai ph ươ ng đỉnh d ưới đỏ là nucleotid T (bình th ường). pháp phân tích minisequencing và StripAssay Hình 5: gia đình này có 6 phôi được để ch ẩn đoán di truy ền tr ước chuy ển phôi sinh thi ết ngày 5 để ch ẩn đoán xác định bệnh β-thalassemia cho các phôi th ụ tinh đột bi ến cho k ết qu ả: 1 phôi bình th ường trong ống nghi ệm c ủa 6 c ặp gia đình không mang gen đột bi ến (phôi s ố 1), 2 mang gen thalassemia tham gia nghiên phôi đồng h ợp t ử Cd17 (phôi 2 và phôi 3) cứu và thu được k ết qu ả sau: và 3 phôi mang gen d ị h ợp t ử Cd17 (phôi số 4, 5, 6). Từ hình ảnh trên cho th ấy m ẫu s ố 1 có xu ất hi ện đỉnh hu ỳnh quang c ủa nucleotid T, đây là v ị trí nucleotid bình th ường. Do v ậy, phôi s ố 1 là phôi không mang gen đột bi ến gây b ệnh. Phôi s ố 2 và phôi s ố 3 đều xu ất hi ện đỉnh hu ỳnh quang c ủa nucleotid A ( đột bi ến). Nh ư v ậy, phôi s ố 2 và phôi số 3 mang gen đồng h ợp t ử Cd17 (phôi b ị bệnh). Các phôi s ố 4, 5, 6 xu ất hi ện c ả 2 Hình 4: Hình ảnh điện di t ự động s ản đỉnh hu ỳnh quang c ủa nucleotide A và T, ph ẩm minisequencing m ẫu tr ường h ợp là các phôi mang gen d ị h ợp t ử Cd17, bố 24, tr ường h ợp m ẹ c ủa gia đình 24. nh ưng s ẽ không bi ểu hi ện b ệnh. 27
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 Bảng 4: Kết qu ả ch ẩn đoán b ệnh β-thalassemia trên phôi nghiên c ứu. STT Mã b ệnh nhân Ki ểu đột bi ến Mã b ệnh nhân Ki ểu đột bi ến THB24 Cd17/ β THM24 Cd17/ β P1.TH24.L1 β/β P2.TH24.L1 Cd17/Cd17 1 P3.TH24.L1 Cd17/Cd17 P4.TH24.L1 Cd17/ β P5.TH24.L1 Cd17/ β P6.TH24.L1 Cd17/ β P1.TH24.L2 Cd17 P2.TH24.L2 Cd17/Cd17 THB48 Cd41/42/ β THM48 IVS1-1/ β 2 P1-TH48 IVS1.1/ β P2-TH48 IVS1.1/ β P1-TH48-L2 IVS1.1/ β P2-TH48-L2 β/β THB51 Cd41/42/ β THM51 IVS1-1/ β 3 P1-TH51 β/β THB57 Cd26/ β THM57 Cd17/ β 4 P1-TH57 Cd26/ β THB58 Cd26/ β THM58 Cd17/ β 5 P1-TH58 β/β THB65 Cd41/42/ β THM65 Cd17/ β P1.TH65 Cd41/42/ β P6.TH65 β/β 6 P2.TH65 Cd17/ β P7.TH65 β/β P3.TH65 β/β P8.TH65 Cd17/ β P4.TH65 β/β P9.TH65 Cd41/42/ β P5.TH65 Cd41/42/Cd17 P10.TH65 β/β Tất c ả 25 m ẫu phôi c ủa 6 gia đình đều phát hi ện đột bi ến, th ấy được di truy ền đột bi ến t ừ b ố m ẹ cho con. Qua đó, đã ch ọn được các phôi lành (hoàn toàn bình th ường ho ặc ch ỉ mang gen đột bi ến) chuy ển vào ng ười m ẹ để sinh ra tr ẻ kh ỏe m ạnh. KẾT LU ẬN TÀI LI ỆU THAM KH ẢO 1. Kham SK, Quah TC, Loong AM, Tan PL, Bước đầu đã áp d ụng thành công quy Fraser A, Chong SS et al . A molecular trình ch ẩn đoán di truy ền tr ước chuy ển epidemiologic study of thalassaemia using phôi b ệnh β-thalassemia b ằng k ỹ thu ật newborns cord blood in a multiracial Asian minisequencing trên phôi th ụ tinh trong population in Singapore: results and recommendations for a population screening ống nghi ệm và ch ọn được các phôi không program. J Pediatr Hematol Oncol. 2004, 26, bị b ệnh để chuy ển vào t ử cung ng ười m ẹ. pp.817-819. 28
7. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 2. Ng IS, Law HY. Challenges in screening preimplantation diagnosis of beta-thalassaemia. and prevention of thalassaemia in Singapore. Chin MedJ (Engl). 2004, 117, pp.483-437. Asian-Ocean Journal of Pediatrics and Child 7. De Rycke M, Van de Velde H, Sermon Health. 2003, 2, pp.29-38. K, Lissens W, De Vos A, VandervorstM et al. 3. Wang W, Kham SK, Yeo GH, Quah TC, Preimplantation genetic diagnosis for sickle- Chong SS. Multiplex minisequencing screen cell anemia and for beta-thalassaemia. Prenat for common Southeast Asian and Indian Diagn. 2001, 21, pp.214-222. betathalassaemia mutations. Clin Chem. 8. Kanavakis E, Vrettou C, Palmer G, 2003, 49, pp.209-218. Tzetis M, Mastrominas M, Traeger-Synodinos J. 4. Kuliev A, Rechitsky S, Verlinsky O, Preimplantation genetic diagnosis in 10 couples Ivakhnenko V, Evsikov S, Wolf G et al. at risk for transmitting beta-thalassaemia major: Preimplantation diagnosis of thalassaemias. clinical experience including theinitiation of six J Assist Reprod Genet. 1998, 15, pp.219-225. singleton pregnancies. Prenat Diagn. 1999, 19, 5. Deng J, Peng WL, Li J, Fang C, Liang XY, pp.1217-2122. Zeng YH et al. Successful preimplantation 9. Chamayou S, Alecci C, Ragolia C, genetic diagnosis for alpha- and beta- Giambona A, Siciliano S, MaggioA et al. thalassaemia in China. Prenat Diagn. 2006, Successful application of preimplantation 26, pp.1021-1028. genetic diagnosis for beta-thalassaemia and 6. Jiao ZX, Zhuang GL, Zhou CQ, Shu YM, sickle cell anemia in Italy. Hum Reprod. 2002, Li J, Liang XY. Birth of healthy children after 17, pp.1158-1165. 29