Kết quả bước đầu phát hiện vi khuẩn lao bằng lamp

Nội dung text: Kết quả bước đầu phát hiện vi khuẩn lao bằng lamp

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO BẰNG LAMP Triệu Tiến Sang*; Trần Văn Khoa*; Nguyễn Duy Bắc* TÓM TẮT Sự phát triển của kỹ thuật làm tăng độ nhạy phát hiện vi khuẩn lao, là một trong những ưu tiên hàng đầu của nghiên cứu phát hiện mầm bệnh lao trong nhiều năm qua vì bệnh lao vẫn là một mối đe dọa lớn tới sức khỏe. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt đoạn vòng lặp kiểu k p tóc (LAMP - loop-mediated isothermal amplification) là phương pháp mới phát hiện axít nucleic, có thể sử dụng được ở những nơi không có trang thiết bị đắt tiền. Mục tiêu: hoàn thiện kỹ thuật LAMP-PCR phát hiện gen đích của Mycobacterium tuberculosis. Phương pháp: 15 mẫu bệnh phẩm đờm của bệnh nhân (BN) lao được xác định, thiết kế mồi trên cơ sở trình tự chèn lặp lại IS6110 như một gen đích cho phản ứng LAMP. Kiểm tra kết quả bằng realtime-PCR, điện di trên gel agarose. Kết quả: đã hoàn thiện được quy trình LAMP-PCR để phát hiện vi khuẩn lao. * Từ khoá: Vi khuẩn lao; Kỹ thuật LAMP. Initial Results of using Lamp in Mycobacterium Tuberculosis Detection Summary Developing techniques to improve sensitivity in Mycobacterium tuberculosis detection is one of the international research priorities recently, because TB remains globally a major health threat. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a new nucleic acid detection method that can be used in laboratories without expensive equipments. Objectives: To develop the LAMP-PCR technique for detecting target genes of Mycobacterium tuberculosis. Subjects and methods: 15 specimens of sputum specimens of TB patients were identified, primer design based on repeat sequence IS6110 as target gene for LAMP-PCR. Examine the results using realtime-PCR and electrophoresis on agarose gel. Results: We have completed the LAMP-PCR process for Mycobacterium tuberculosis detection. * Keywords: Mycobacterium tuberculosis; LAMP technique. ĐẶT VẤN ĐỀ đề quan trọng trong việc phòng chống bệnh Hiện nay, bệnh lao vẫn là nguyên nhân này trên toàn cầu [4 . Do tính đơn giản và thứ hai gây tử vong do một tác nhân chi phí thấp nên phương pháp soi dịch đờm nhiễm trùng đơn lẻ. Chẩn đoán nhanh và vẫn là kỹ thuật chẩn đoán thường quy hiệu quả bệnh lao là một trong những vấn cho bệnh lao ở các nước đang phát triển. * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Duy Bắc (bac_hvqy@yahoo.com) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 04/09/2017 330
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Tuy nhiên, kỹ thuật này có độ nhạy thấp. lượng lớn muối kết tủa của magiê Xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn cho độ pyrophosphat được tạo ra như một sản nhạy cao hơn là tiêu chuẩn vàng, song phẩm phụ làm tăng độ đục của hỗn hợp nuôi cấy vi khuẩn là phương pháp tốn phản ứng, cho phép phát hiện bằng mắt thời gian, đòi hỏi kỹ thuật chuyên môn và thường hoặc đo độ đục. Do đó, không chỉ thực hiện được tại các cơ sở chuyên cần thiết bị đòi hỏi tốn nhiều thời gian cho ngành. Mặt khác, hình ảnh chụp X quang bước phát hiện sau khuếch đại. trong nhiều trường hợp không rõ ràng [5 . Các kỹ thuật dựa trên PCR là một trong ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP những phương pháp mới hứa h n và hấp NGHIÊN CỨU dẫn nhất so với các phương pháp thông 1. Đối tƣợngnghiên cứu. thường. Tuy nhiên, không phải nơi nào 15 mẫu đờm lâm sàng được lấy từ BN cũng có điều kiện thực hiện do hạn chế đã xác nhận mắc lao (TB), do Trung tâm về trang thiết bị, kỹ thuật. Phòng chống Lao Hà Nội cung cấp. Tách Gần đây, một kỹ thuật khuếch đại axít ADN từ mẫu bằng kít Qiagen, 10 ul ADN nucleic mới được mô tả, có tên là LAMP tách chiết được sử dụng cho mỗi phản (Loop-Mediated Isothermal Amplification) ứng LAMP dưới điều kiện tối ưu. Để kiểm [6 . LAMP có nhiều ưu điểm hơn so với soát nhiễm chéo, sử dụng 1 đối chứng phương pháp PCR thông thường. Thứ âm cho mỗi 3 phản ứng lâm sàng của mẫu. nhất, phản ứng LAMP thực hiện ở nhiệt 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. độ cố định (60 - 650C), điều này giúp tiết kiệm thời gian và thuận tiện hơn vì không * LAMP primer: cần phải mua thiết bị đắt tiền. Thứ hai, Để phát triển một kỹ thuật LAMP thành LAMP là một phản ứng đặc hiệu, vì nó sử công, thiết kế mồi là bước quan trọng dụng 4 hoặc 6 mồi khác nhau nhận biết nhất. Chúng tôi đã tham khảo và sử dụng nhiều vùng khác biệt trên trình tự đích. 6 trình tự mồi khác nhau để nhân một gen Thứ ba, kỹ thuật LAMP cho kết quả với đích làm tăng độ đặc hiệu. hiệu suất cao trong tổng hợp sản phẩm Đặc điểm của các primers ADN khuếch đại, ít nhất là 50 lần so với phản oligonucleotide sử dụng cho IS6110-LAMP ứng PCR thông thường ở cùng một thể phát hiện Mycobacterium tuberculosis tích. Cùng với phản ứng khuyếch đại, một như dưới đây: ’ ’ Sản phẩm Primer Tr nh tự (5 -3 ) Chiều dài Vị trí đích (bp) IS-FOP AGACCTCACCTATGTGTCGA 20-mer 812-831 IS-BOP TCGCTGAACCGGATCGA 17-mer 1029-1045 169 IS-FIP ATGGAGGTGGCCATCGTGGAAG 41-mer 904-925, 847-865 (F1c+F2) CCTACGTGGCCTTTGTCAC 331
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 IS-BIP AAGCCATCTGGACCCGCCAA 40-mer 946-965, 996-1015 (B1c+B2) CCCCTATCCGTATGGTGGAT IS-FLP AGGATCCTGCGAGCGTAG 18-mer 872-889 IS-BLP AAGAAGGCGTACTCGACCTG 20-mer 967-986 Hình 1: M. Tuberculosis. Sơ đồ và vị trí gắn mồi trên đoạn gen IS6110 của ((A) Sơ đồ trình tự của IS6110 đầy đủ như trên mũi tên đen đậm được đánh dấu vị trí: phần trên cùng (A) cho thấy vùng khuếch đại đích bởi PCR và các mồi nested PCR; phần dưới (A) cho thấy 8 vùng khác nhau được nhận diện bởi primer của LAMP Mồi xuôi bên ngoài (FOP) và mồi ngược bên ngoài (BOP) lần lượt tương ứng với các trình tự của các vùng F3 và B3 của đích Mồi xuôi bên trong (FIP) chứa trình tự có nghĩa của vùng F2 ở đầu 3’ được kết nối trực tiếp với trình tự F1c (trình tự bổ sung tới trình tự F1) ở đầu 5’, và mồi ngược bên trong (BIP) chứa trình tự có nghĩa của vùng B2 tại đầu 3’ trực tiếp liên kết với B1c (bổ sung trình tự đến vùng B1) ở đầu 5’ Mồi xuôi vòng (FLP) và mồi ngược vòng (BLP), lần lượt chứa trình tự bổ sung cho một phần của trình tự giữa F1 và F2 và giữa các vùng B1 và B2 (B) Vị trí gắn mồi và vị trí khuếch đại của mồi LAMP trên đích 234bp được chọn của IS6110 Dấu (*) cho biết các biến thể dựa trên chuỗi IS6110 của các chủng lao khác nhau) 332
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Phản ứng LAMP-PCR: - Quan sát bằng mắt thường thông Kỹ thuật LAMP được tối ưu hóa ở thể qua biến đổi độ đục của dung dịch phản ứng: mẫu dương tính sẽ cho màu trắng tích tổng cộng 25 ul, sử dụng 15 ul đục, mẫu âm tính có màu trong suốt. Isothermal Master mix cho LAMP - Quan sát sau khi nhuộm bằng thuốc (OptiGene, Anh), 0,1% uM mỗi IS-FIP và nhuộm huỳnh quang (thường dùng là IS-BIP, 0,2 uM mỗi IS-FOP và IS-BOP, SYBR green I) bổ sung trực tiếp vào ống 0,8 uM mỗi IS-FLP và IS-BLP, 2 mM PCR: mẫu dương tính sẽ cho màu xanh, dNTPs, 6 mM MgSO4, 8U Bst ADN mẫu âm tính có màu vàng cam. polymerase và 5 ul ADN khuôn từ mẫu - Điện di agarose thường: mẫu dương tách chiết. Phản ứng thực hiện ở nhiệt độ tính cho kết quả băng điện di có dạng tối ưu là 650C trong 90 phút, kết thúc nhiều băng vạch giống như thang chuẩn, bằng bất hoạt enzym ở 900C trong 2 phút. mẫu âm tính có dạng dải smear của ADN khuôn và các dimer. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Trong nghiên cứu này, do chúng tôi sử dụng master mix đã có sẵn SYBR green I, Để kiểm tra, đánh giá kết quả phản có thể kiểm tra trên máy realtime-PCR và ứng LAMP, thông thường chỉ cần một diện di trên gel agarose (khi áp dụng trong trong các cách thức là: thực tế, không cần thiết bị realtime-PCR). 1. Kết quả đánh giá qua điện di trên agarose. Hình 2: Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP-PCR trên 15 mẫu nghiên cứu. (M: thang ADN, 100 bp; (-) và (+): mẫu chứng âm và mẫu chứng dương; 1-15: 15 mẫu dương tính) 2. Kết quả đánh giá qua tín hiệu huỳnh quang trên hệ thống realtime. Độ nhạy cao của kỹ thuật IS6110-LAMP phụ thuộc vào thời gian của phản ứng khuếch đại. Để khảo sát thời gian theo thời gian thực, chúng tôi khảo sát trên máy 333
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 realtime-PCR. LAMP có đặc điểm diễn ra liên tục trong điều kiện đẳng nhiệt. Vì vậy, chúng tôi xác định thời gian theo chu kỳ giả định, mỗi chu kỳ phản ứng tương đương với 1 phút. Hình 3: Hình ảnh LAMP-PCR trên hệ thống realtime. (Ký hiệu trên trái (-) và dưới cùng bên phải (+): mẫu chứng dương và mẫu chứng âm; còn lại: các mẫu bệnh phẩm lâm sàng) Hình ảnh cho thấy, hầu hết các mẫu có tăng tín hiệu chỉ sau 20 phút, 1 mẫu số 12 tăng tín hiệu sau 50 phút. Trong khi đó, mẫu chứng âm sau 85 phút không thấy tăng tín hiệu huỳnh quang. BÀN LUẬN sản phẩm được khuếch đại LAMP do kết Các kỹ thuật dựa trên LAMP với đích quả nhân lên kiểu vòng lặp. Kích thước gyrB và rrs gần đây đã được mô tả nhằm sản phẩm các đoạn lặp trong phản ứng phát hiện ra vi khuẩn lao [1, 3 . Trong LAMP vào khoảng 169 bp (băng vị trí nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thấp nhất trên bản gel) trên gel agarose, thuật LAMP để phát hiện vi khuẩn lao cho thấy khuếch đại đặc hiệu của trình tự dựa trên khuếch đại trình tự chèn 6110 đích như thiết kế. (IS6110). IS6110, đặc trưng cho chủng M. Kết quả thể hiện qua phản ứng LAMP tuberculosis. Hơn nữa, hầu hết các thành trên thiết bị realtime cũng cho thấy sự viên của vi khuẩn lao chứa nhiều bản sao trùng lặp (hình 3). của IS6110, do đó sử dụng gen mục tiêu Bên cạnh việc tăng độ nhạy, một lợi này sẽ làm tăng độ nhạy [7 . thế lớn khác của kỹ thuật LAMP so với Qua kết quả nhân gen và kiểm tra PCR và nested-PCR là thời gian tiến bằng điện di trên gel agarose (hình 2) cho hành kỹ thuật, chỉ cần khoảng 1,5 giờ để thấy các mẫu có dạng nhiều băng vạch, thực hiện kỹ thuật LAMP-PCR so với 2,5 cấu trúc hình thang ADN đặc trưng của giờ đối với kỹ thuật PCR thường và 334
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 khoảng 5 giờ đối với kỹ thuật nested- tuberculosis: modern molecular epidemiology PCR. Ngoài ra, đối với lượng ADN lớn and perspectives. In: Tibayrenc M, editor. được sử dụng trong kỹ thuật LAMP, kết Encyclopedia of infectious diseases: modern methodologies. Wiley-Liss, New Jersey. 2007, quả dương tính có thể thu được trong pp.1-29. vòng 20 phút (hình 3). Do đó, có thể xem 3. Iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K. Loop- xét cải tiến kỹ thuật LAMP bằng cách kết mediated isothermal amplification for direct hợp nó với một thiết bị đo độ đục trong detection of Mycobacterium tuberculosis thời gian thực. Điều này sẽ cho phép thu complex, M. avium and M. intracellulare in được kết quả xét nghiệm nhanh hơn khi sputum samples. J Clin Microbiol. 2003, 41 các mẫu có lượng trực khuẩn cao. (6), pp.2616-2622. 4. Keeler E, Perkins MD, Small P, Hanson KẾT LUẬN C, Reed S, Cunningham J et al. Reducing the Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy global burden of tuberculosis: the contribution LAMP-PCR là kỹ thuật rẻ tiền và phát of improved diagnostics. Nature. 2006, 444 hiện nhanh vi khuẩn laotrong điều kiện (1), pp.49-57. Việt Nam.Hiện tại, chúng tôi đang thực 5. Koppaka R, Bock N. How reliable is hiện kỹ thuật MTB-LAMP trên một số chest radiography? In: Frieden T, editor. lượng lớn mẫu bệnh phẩm lâm sàng để Toman’s tuberculosis case detection, đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ treatment and monitoring: questions and answers. World Health Organization, Geneva. thuật. 2004, pp.51-60. TÀI LIỆU THAM KHẢO 6. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, 1. Boehme CC, Nabeta P, Henostroza G, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N et Raqib R, Rahim Z, Gerhardt M et al. al.Loop-mediated isothermal amplification of Operational feasibility of using loop-mediated DNA. Nucleic acids Res. 2000, 28 (12), p.63. isothermal amplification for diagnosis of 7. Thierry D, Brisson-Noel A, Vincent-Levy- pulmonary tuberculosis in microscopy centers Frebault V, Nguyen S, Guesdon JL, Gicquel of developing countries. J Clin Microbiol. B. Characterization of a Mycobactenum 2007, 45 (6), pp.1936-1940. tuberculosis insertion sequence, IS6110 and 2. Godreuil S, Tazi L, Ban˜uls AL its application in diagnosis. J Clin Microbiol. Pulmonary tuberculosis and Mycobacterium 1990, 28 (12), pp.2668-2273. 335