Kết quả bước đầu nghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết để chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi

Nội dung text: Kết quả bước đầu nghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết để chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi

1. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI PHÔI SAU SINH THIẾT ĐỂ CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN TRƢỚC CHUYỂN PHÔI Nguyễn Ngọc Diệp*; Nguyễn Thanh Tùng*; Quản Hoàng Lâm* TÓM TẮT Việc đánh giá về hình thái phôi trong thụ tinh trong ống nghiệm chưa phản ánh đầy đủ chất lượng thực của phôi. Để nâng cao chất lượng trong điều trị, chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetic Diagnosis/PGD) là một trong những yêu cầu quan trọng, cấp thiết và thực tiễn. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm đánh giá thay đổi hình thái của phôi sau sinh thiết. 60 phôi được chia làm 2 nhóm. Nhóm 1: 30 phôi được sinh thiết vào ngày 3, tiếp tục nuôi cấy và lượng giá hình thái phôi sau sinh thiết, so sánh với 30 phôi nhóm chứng. Kết quả: tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tỷ lệ phôi sống sót, tỷ lệ tạo thành blastocyst, đường kính của phôi và độ dày màng trong suốt thay đổi không có ý nghĩa thống kê. * Từ khóa: Hình thái phôi; Chẩn đoán di truyền; Chuyển phôi. initial results of embryo morphology after biopsy in preimplantation genetic diagnosis Summary In vitro fertilization, morphological assessment not fully reflect the true quality of the embryos. To improve the quality of treatment, the preimplantation genetic diagnosis is one of the critical requirements, urgent and practical. We conducted a study to examine the assessment of embryo morphology changes after biopsy. 60 embryos were divided into 2 groups, group 1: 30 embryo biopsy on day 3, and continue culture, morphology evaluation after biopsy, compared with the control group embryos. Results: fragment ratio, embryo survival rate, blastocyst forming rate, the diameter of the embryo and ZP thickness change not significantly. * Key words: Embryo morphology; Genetic diagnosis; Embryo implantation. ĐẶT VẤN ĐỀ hình thái, kết quả điều trị thụ tinh ống nghiệm bị hạn chế. Nhiều phôi có chỉ số Hiện nay, hầu như việc lựa chọn phôi hình thái cao, nhưng không làm tổ được đều dựa trên những tiêu chuẩn về hình thái hoặc không tạo ra trẻ khoẻ mạnh. Ngược lại, của phôi. Tuy nhiên, việc đánh giá về hình có khi phôi có các chỉ số hình thái kém hơn, thái chưa phản ánh đầy đủ chất lượng thực lại tạo ra em bé bình thường. Trong nhiều của phôi, nếu chỉ dựa vào các thông số về trường hợp, lý do phôi không phát triển, * Häc viÖn Qu©n y Ng•êi ph¶n håi (Corresponding): NguyÔn Ngäc DiÖp (nndiep301@gmail.com) Ngµy nhËn bµi: 20/5/2013; Ngµy ph¶n biÖn ®¸nh gi¸ bµi b¸o: 20/6/2013 Ngµy bµi b¸o ®•îc ®¨ng: 24/6/2013 33
2. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 không làm tổ được hoặc bị sảy thai sớm là * Tiêu chuẩn loại trừ: phôi giai đoạn do chất lượng của phôi. Ví dụ, bị rối loạn về sớm độ I, độ II; các tế bào không đồng đều, số lượng nhiễm sắc thể gây ảnh hưởng đến tỷ lệ mảnh vỡ bào tương ≥ 20%. sự sống và phát triển của phôi [4]. Để nâng cao chất lượng trong điều trị 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. cũng như đảm bảo cho ra đời một thế hệ khoẻ mạnh về thể lực, sáng suốt về tinh * Kích thích buồng trứng: thần, đồng thời sàng lọc một số bệnh di truyền, việc chẩn đoán di truyền trước chuyển - Phác đồ dài, sử dụng GnRHa để ức phôi (PGD) là một trong những yêu cầu chế hormon FSH, LH của tuyến yên, điều quan trọng, cấp thiết và thực tiễn. Nguyên hoà xuống 14 ngày, bắt đầu từ ngày 21 của tắc kỹ thuật của PGD dựa trên việc thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) chu k ỳ kinh. Sau đó sử dụng rFSH tái tổng để tạo phôi, sau đó sinh thiết phôi và phân hợp kích thích nang trứng. tích nhiễm sắc thể hoặc ADN bằng kỹ thuật FISH, CGH hoặc PCR [2]. - Phác đồ ngắn: dùng FSH từ N2 chu kỳ Kỹ thuật sinh thiết phôi là kỹ thuật xâm kinh. lấn, đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ, chính xác. Vì vậy, trong quá trình thực hiện có thể ảnh - Phác đồ GnRH antagonists (Cetrotide, hưởng đến chất lượng của phôi. Song song Serono, Mỹ): bệnh nhân (BN) được kích thích với công việc hoàn thiện quy trình sinh thiết bằng FSH tái tổng hợp (Gonal-F, Serono), phôi, chúng tôi tiến hành đánh giá hình thái có thể kết hợp với menopur từ ngày thứ 2 phôi, đồng thời theo dõi khả năng phát triển của chu kỳ kinh. Sử dụng antagonist sau của phôi sau sinh thiết. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm: 5 - 6 ngày dùng FSH. Đánh giá sự thay đổi hình thái của phôi sau sinh thiết. HCG (5.000 - 10.000 IU Profasi, Serono; Pregnyl, Organon) chỉ định khi có ít nhất ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP trên 2 nang noãn có kích thước > 17 mm. NGHIÊN CỨU 1. Đối tƣợng nghiên cứu. * Đánh giá thụ tinh và quá trình nuôi cấy phôi: - 60 phôi người còn dư khi TTTON. Chia đối tượng nghiên cứu thành 2 nhóm: Khoảng 16 - 18 giờ sau khi tiêm tinh - Nhóm I: 30 phôi sinh thiết vào ngày 3 trùng vào trứng, đánh giá trứng xem có thụ trong quá trình nuôi cấy. tinh hay không. Nếu đã thụ tinh tạo thành - Nhóm II: 30 phôi không sinh thiết (nhóm phôi sẽ xuất hiện 2 tiền nhân và 2 thể cực. chứng). Sau đó, đánh giá phôi ghi điểm ở từng thời * Tiêu chuẩn lựa chọn phôi để sinh thiết: phôi được nuôi cấy đến ngày thứ 3 trong điểm 36; 48 giờ sau thụ tinh. thu thập số môi trường nuôi cấy TTTON. Phôi có tế bào lượng và hình thể của nhân, tế bào phôi và đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương (fragment) thể loại mảnh vỡ để đánh giá chất lượng < 20% (phôi độ III, độ IV). phôi [1, 3]. * Sinh thiết tế bào phôi: 34
3. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 Phương pháp chi tiết sinh thiết một phôi bào từ phôi đang thời kỳ phân cắt bằng tia laser như sau: dùng kim sinh thiết hút nhẹ nhàng 1 tế bào của phôi vào ngày thứ 3 (66 - 68 giờ sau tiêm tinh trùng) khi phôi có ít nhất 4 tế bào và có số lượng mảnh vỡ không quá 30%. Sau đó, chuyển phôi lại vào môi trường nuôi cấy cho đến ngày 5 [2]. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Hình thái phôi trong quá trình phát triển sau sinh thiết. Bảng 1: Hình thái phôi trong quá trình phát triển sau sinh thiết ở thời điểm 3 ngày tuổi. NGÀY NGÀY 3 NGÀY 4 NGÀY 5 X ± SD ± SD ± SD p NHÓM (n = 30) (tỷ lệ mảnh vỡ bào (tỷ lệ phôi sống sót) (tỷ lệ tạo thành blastocyst) tương) (%) Sinh thiết (I) 8,63 92,22 89,81 p1-2 < 0,01 Chứng (II) 8,82 93,13 90,10 Tại thời điểm ngày 3, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tại thời điểm ngày 4, tỷ lệ phôi sống sót và tại thời điểm ngày 5, tỷ lệ tạo thành bastocyst giữa 2 nhóm trong quá trình phát triển sau sinh thiết khác biệt không có ý nghĩa thống kê. 2. Đƣờng kính của phôi trong quá trình phát triển sau sinh thiết. Bảng 2: NGÀY NGÀY 3 NGÀY 4 NGÀY 5 p ± SD ± SD ± SD NHÓM (n = 30) Sinh thiết (I) 150,20 ± 7,85 151,50 ± 6,32 152,40 ± 6,42 p1-2 < 0,01 Chứng (II) 149,50 ± 8,15 152,50 ± 5,32 152,60 ± 7,45 3. Độ dày màng trong suốt của phôi trong quá trình phát triển sau sinh thiết ở thời điểm 3 ngày tuổi. Bảng 3: NGÀY NGÀY 3 NGÀY 4 NGÀY 5 ± SD ± SD ± SD NHÓM (n = 30) Sinh thiết (I) 16,10 ± 1,12 15,80 ± 1,13 15,70 ± 1,14 p1-2 < 0,01 Chứng (II) 16,80 ± 1,20 16,30 ± 1,20 16,20 ± 1,22 * Một số hình ảnh phôi trong quá trình ngược Olympus gắn phần mềm trên máy sinh thiết và nuôi cấy dưới kính hiển vi đảo sinh thiết Saturn Active x400: 36
4. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 Hình 3: Phôi sau sinh thiết 36 giờ. Hình 4: Phôi thoát màng sau sinh thiết 48 giờ. Hình 1: Phôi trước sinh thiết. BÀN LUẬN Phương pháp kích thích buồng trứng trong hỗ trợ sinh sản thường tạo được nhiều trứng để thụ tinh và tạo ra nhiều phôi cho mỗi chu kỳ điều trị. Những năm trước đây, hầu hết các trung tâm điều trị TTTON đều có xu hướng chuyển nhiều phôi vào buồng tử cung để tăng tỷ lệ có thai, nhưng đồng thời cũng làm tăng nguy cơ đa thai. Đa thai thường liên quan nhiều đến biến chứng cho cả mẹ và con. Ví dụ, mẹ có thể bị tiền sản giật, chảy máu sau đẻ, phải cắt bỏ tử cung hoặc đái đường khi mang thai, trẻ sơ sinh dễ bị nhẹ cân, đẻ non, bại não Hình 2: Phôi sau sinh thiết 0 giờ. và các dị tật bẩm sinh. Vì vậy, hiện nay nhiều trung tâm TTTON đang cố gắng giới hạn số lượng phôi chuyển, có thể chuyển đơn phôi vào buồng tử cung và giảm nguy cơ nói trên, do ®ã giảm số lượng đa thai đáng kể. Tuy nhiên, việc giảm số lượng phôi chuyển lại làm giảm tỷ lệ có thai trong điều trị hỗ trợ sinh sản. Nguồn gốc của vấn đề là do phôi được chuyển không có khả năng sống và phát triển như nhau. Để làm tăng tỷ lệ có thai như mong muốn, giảm số lượng phôi chuyển vào buồng tử cung, đồng thời giảm tỷ lệ nguy cơ cho mẹ và con, điều cần 37
5. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 thiết là phải chọn lọc được phôi có khả Kết quả cho thấy cấu trúc hình thái phôi năng làm tổ cao nhất để chuyển phôi. ngày 3, ngày 5 thay đổi trước và sau sinh Phương pháp phổ biến được sử dụng ở đa thiết về đường kính phôi, độ dày màng số các trung tâm TTTON để đánh giá phôi trong suốt không có ý nghĩa thống kê tốt hay xấu phần lớn dựa vào các chỉ số (p > 0,05). Có thể đây là một minh chứng hình thái, ví dụ như số lượng, kích thước cho quy trình sinh thiết phôi mà chúng tôi của tế bào phôi, sự có mặt và phân bố các đang sử dụng là ổn định, đáng tin cậy. mảnh vỡ bào tương, đa nhân và tốc độ Kết quả nghiên cứu này phù hợp với phân chia của phôi. Đánh giá phôi theo hình Trương Đình Kiệt và các tác giả khác trên thái nói trên tuy chưa thể đảm bảo được thế giới [2, 5, 6]. yêu cầu quan trọng nhất là khả năng sống và phát triển bình thường của phôi, nhưng KẾT LUẬN có ưu điểm là nhanh và dễ dàng thực hiện. Qua nghiên cứu bước đầu, chúng tôi rút Đề tài chẩn đoán di truyền trước chuyển ra kết luận sau: phôi nghiên cứu chất lượng của phôi trước Quy trình sinh thiết bằng tia laser và kỹ khi làm tổ nhằm bổ sung thêm kỹ thuật thuật tiến hành một cách chu đáo và tỉ mỉ, sàng lọc phôi, đồng thời sàng lọc một số không ảnh hưởng đến cấu trúc cũng như bệnh di truyền trước chuyển phôi. Trong quá trình phát triển của phôi. Thể hiện bằng khuôn khổ đề tài này, đánh giá sự biến đổi tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tỷ lệ phôi sống hình thái cấu trúc phôi sau sinh thiết [9] là sót, tỷ lệ tạo thành blastocyst, đường kính một lĩnh vực còn mới ở Việt Nam, chưa có của phôi và độ dày màng trong suốt thay công trình nào nghiên cứu một cách bài bản. đổi không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy, đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, góp phần nâng cao chất lượng trong TÀI LIỆU THAM KHẢO điều trị vô sinh. 1. Đoàn Thị Hằng. Nghiên cứu biến đổi hình Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng thái cấu trúc phôi người ngày 3, ngày 5 trước cách phân độ phôi của Andres Salumets đông lạnh và sau rã đông bằng kỹ thuật thuỷ tinh và CS (2001) [10], cách phân độ phôi này hóa. Luận án Tiến sỹ Y học. 2013. đơn giản phù hợp với thời gian ngắn 2 - 3 2. Trương Đình Kiệt, Hồ Mạnh Tường. Thiết phút khi quan sát phôi ở ngoài tủ nuôi lập quy trình kỹ thuật trong chẩn đoán di truyền cấy. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy tiền làm tổ (PGD) các phôi TTTON. Báo cáo đề cách đánh giá hình thái phôi này hoàn tài cấp thành phố 4/2011. toàn có thể tiên lượng được khả năng 3. Nguyễn Thanh Tùng. Nghiên cứu hình thái sống của phôi sau sinh thiết để chuyển cấu trúc hợp tử giai đoạn tiền nhân và phôi hai cho bệnh nhân [3]. ngày tuổi trên bệnh nhân TTTON. Luận án Tiến sỹ Y học. 2011. Trong nghiên cứu, chúng tôi đã chụp ảnh tất cả phôi trước và sau sinh thiết, 4. Gardner D.K, Lane M. Embryo culture. tính tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tỷ lệ phôi Textbook of Assisted Reproductive Techniques. sống sót, tỷ lệ tạo thành blastocyst, đo độ 2001, pp.203-222. dày màng trong suốt và đường kính phôi. 38
6. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 5. Hardarson. T Hanson C, Sjogren A. Human 8. Kirstine Kirkegaard, Johnny Juhl Hindkjaer. embryos with uneven sized blastomeres have Human embryonic development after blastomere lower pregnancy and implantation rates: indication removal: a time-lapse analysis. Hum Reprod. for aneuploidy and multinucleation. Human 2012, Jan, 27 (1), pp.97-105. Reproduction. 2001, 16, pp.313-318. 9. Kyrou D, Popovic-Todorovic B. Does the 6. Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, estradiol level on the day of human chorionic Winston RM. Pregnancies from biopsied human gonadotrophin administration have an impact on preimplantation embryos sexed by Y-specific pregnancy rates in patients treated with rec- DNA amplification. Nature. 1990, Apr 19, 344 FSH/GnRH antagonist?. Hum Reprod. 2009, (6268), pp.768-770. Nov, 24 (11), pp.2902-2909. 7. Joris H, De Vos A, Janssens R, Devroey 10. Salumets A, Hydén-Granskog C, Suikkari P, Liebaers I. Comparison of the results of AM, Tiitinen A. The predictive value of pronuclear human embryo biopsy and outcome of PGD morphology of zygotes in the assessment of after zona drilling using acid tyrode medium or a human embryo quality. Hum Reprod. 2001, Oct, laser. Fertil Steril. 2006, Feb, 85 (2), pp.487-491. 16 (10), pp.2177-2181. 39
7. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 40