Hoàn thiện quy trình phát hiện bất thường nhiễm sắc thể trước chuyển phôi bằng kỹ thuật fish

Nội dung text: Hoàn thiện quy trình phát hiện bất thường nhiễm sắc thể trước chuyển phôi bằng kỹ thuật fish

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHÁT HIỆN BẤT THƢỜNG NHIỄM SẮC THỂ TRƢỚC CHUYỂN PHÔI BẰNG KỸ THUẬT FISH Triệu Tiến Sang*; Trần Văn Khoa*; Nguyễn Thị Việt Hà* Nguyễn Đình Tảo*; Đỗ Minh Trung*; Đỗ Ngọc Ánh* TÓM TẮT Mục tiêu: phát hiện bất thường nhi m sắc thể (NST) trước chuyển phôi trên các phôi thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) góp phần nâng cao hiệu quả chuyển phôi và phôi làm tổ của các phôi chuyển. Đối tượng và phương pháp: 50 mẫu phôi dư được sinh thiết tại Trung tâm Công nghệ Phôi, Học viện Quân y. Sử dụng kỹ thuật FISH xác định bất thường số lượng NST của phôi. Kết quả: kỹ thuật FISH sau khi hoàn thiện đã chẩn đoán được 50 phôi; trong đó 21 phôi có lệch bội. Kết luận: đã hoàn thiện và áp dụng được quy trình phát hiện bất thường NST trước chuyển phôi trên các phôi TTTON. * Từ khóa: Thụ tinh trong ống nghiệm; Chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi; Lệch bội nhi m sắc thể. Having Process Detected Aneuploidy before Embryo Transfer by FISH Technique Summary Objectives: To detect aneuploidy before embryo transfer in IVF embryos contribute to improve embryo transfer and embryo implantation efficiency. Subjects and methods: 50 surplus embryos obtained at Embyonic Technology Center, Military Medical University. Using FISH technique for detection of aneuploidy of embryos. Results: FISH technique was applied successfully in detection of aneuploidy in 50 embryos, of which, 21 embryos were identified as aneuploidy. Conclusion: FISH technique was applied successfully in detection aneuploidy in embryos before embryo transfer. * Key words: IVF; Pre-implantation genetic diagnosis; Aneuploidy. ĐẶT VẤN ĐỀ trong nhiều trường hợp, nguyên nhân khiến người phụ nữ không có thai sau khi được Hiện nay, tỷ lệ vô sinh chiếm khoảng chuy ển phôi là do phôi có bất thường về 5 - 10% các cặp vợ chồng trong độ tuổi số lượng NST như vô nhi m, đơn nhi m, sinh sản. Cùng với sự phát triển của khoa tam nhi m... Hiện tượng lệch bội NST ở học, kỹ thuật TTTON (In Vitro Fertilization - phôi người trong quá trình điều trị bằng IVF) đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực TTTON đã được nêu ra từ lâu và nhiều hỗ trợ sinh sản và ngày càng phát triển nghiên cứu cũng công nhận hiện tượng rộng khắp nơi trên thế giới. Tuy nhiên, này xảy ra ở giai đoạn trước khi làm tổ. * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Triệu Tiến Sang (trieusangk83@yahoo.com.vn) Ngày nhận bài: 10/12/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/02/2016 Ngày bài báo được đăng: 07/03/2016 53
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Vì vậy, trước khi cấy chuyển phôi bào bảo quản trong các giọt dầu và chuyển cần chẩn đoán bất thường NST. PGD sang Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học (Pre-implantation Genetic Diagnosis) là Quân sự, Học viện Quân y để tiến hành quá trình chẩn đoán di truyền trước làm tổ, thực hiện kỹ thuật FISH. kỹ thuật này giúp cho việc có thể chọn * Quy trình FISH: được tương đối chính xác những phôi - Công đoạn cố định TB lên lam kính: không có bất thường về di truyền để cấy chuẩn bị đĩa petri có nhỏ sẵn các giọt vào tử cung người mẹ. Từ đó, nâng cao tỷ dung dịch. Quan sát dưới kính hiển vi soi lệ thành công của kỹ thuật TTTON, giúp nổi, hút một TB phôi, sau đó đặt vào giọt cho ra đời các em bé khỏe mạnh. Vì vậy, thứ nhất (giọt dung dịch PBS) để rửa chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm: sạch dầu (lớp dầu bảo quản TB phôi). Hoàn thiện quy trình phát hiện bất thường Sau đó, hút chuyển các TB sang giọt thứ NST trước chuyển phôi bằng kỹ thuật FISH. hai (dung dịch nhược trương). Ở giọt thứ ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP hai, sau khoảng 5 phút, hút TB và đặt lên NGHIÊN CỨU lam kính. Khi thấy vị trí có TB gần khô hoàn toàn, tiến hành nhỏ lần lượt từng . Đối tƣợng nghiên cứu. giọt dung dịch cố định lên vòng tròn đã 50 tế bào (TB) phôi được sinh thiết từ khoanh, mỗi giọt khoảng 2 µl. Giọt trước các phôi dư (lưu trữ tại Trung tâm Công khô mới tiếp tục nhỏ giọt tiếp theo. Khi nghệ Phôi, Học viện Quân y). thấy hình ảnh nhân TB rõ ràng thì dừng - Hóa chất kỹ thuật FISH: việc nhỏ dung dịch cố định. Để tiêu bản Sử dụng bộ kít Vysis MultiVysion PGT: khô ở nhiệt độ phòng. có đầu dò đối với các NST 13, 18, 21, - Công đoạn lai đầu dò với TB bạch cầu X và Y. Dung dịch nhược trương (1% Na và TB phôi: ngâm tiêu bản vào methanol citrate và 6 mg/ml HSA); dung dịch cố trong 2 phút. Sau đó lấy ra để tiêu bản định (Carnoy 3:1); methanol 100%; dung khô ở nhiệt độ phòng. Lấy mẫu dò ADN dịch 0,4X SSC/0,3% NP40; 2X SSC/0,1% MultiVysion PGT từ tủ bảo quản -200C để NP40; antiface II; cement (chất gắn lamen). ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng từ - Thiết bị: kính hiển vi soi nổi, buồng lai, 5 - 10 phút. Nhỏ 3 µl mẫu dò lên vùng lai tủ ổn nhiệt, bể ổn nhiệt, kính hiển vi huỳnh có chứa TB đã được đánh dấu. Đặt nhẹ quang. nhàng lamen phủ lên vùng lai. Gắn rubber cement quanh vị trí mép lamen để tránh 2. Phƣơ g pháp ghi cứu. bay hơi dung dịch mẫu dò trong quá * Quy trình thụ tinh bằng phương pháp trình lai. Đặt lam mẫu vào buồng lai. Đặt ICSI và quy trình sinh thiết TB phôi: chương trình: 730C trong 10 phút, 370C Quy trình thụ tinh bằng phương pháp trong 3 giờ. ICSI và quy trình sinh thiết các TB phôi - Công đoạn rửa tiêu bản sau lai: lấy ngày được tiến hành tại Trung tâm Công tiêu bản ra khỏi buồng lai, nhẹ nhàng gỡ bỏ nghệ Phôi, Học viện Quân y. TB phôi sau rubber cement và lamen. Nhúng tiêu bản khi sinh thiết được đặt lên đĩa sinh thiết, vào cốc đựng dung dịch 0,4X SSC/0,3% 54
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 NP40 trong 2 phút. Dung dịch này phải Trong quá trình thực hiện kỹ thuật, đạt được 730C từ trước khi sử dụng. Sau chúng tôi thấy công đoạn cố định TB lên đó, lấy tiêu bản ra, nhúng tiếp vào cốc lam kính hết sức quan trọng, cần đặc biệt đựng dung dịch 2X SSC/0,1% NP40 ở chú ý tới bước nhỏ dung dịch Carnoy cố nhiệt độ phòng trong 1 phút. Lấy tiêu bản định lên vị trí có TB phôi. Nếu TB phôi bị ra để khô hoàn toàn trong tủ ấm 370C bong khỏi lam trong quá trình thao tác thì (tránh ánh sáng). kỹ thuật thất bại. - Công đoạn phân tích tín hiệu sau lai: Các chú ý trong quá trình gắn TB lên sau khi lam khô, nhỏ 3 µl antifade II lên lam kính: hút TB hết sức cẩn thận, nhẹ vùng lai và đậy lamen kính lên trên. Quan nhàng, tránh làm vỡ TB khi rửa trong giọt sát phân tích tín hiệu lai dưới kính hiển vi PBS 1X. Rửa sạch dung dịch dầu, nếu huỳnh quang với từng phin lọc thích hợp, rửa không sạch dầu vẫn bám lên bề mặt đưa ra kết luận với từng mẫu phôi bào TB phôi, do vậy không thể làm nhược cụ thể. trương để bộc lộ nhân TB. Khi đó, quá trình lai với các tín hiệu đầu dò sẽ thất KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ bại. Dung dịch nhược trương phải đảm BÀN LUẬN bảo được pha mới trong ngày, không quá 1. Kết quả hoàn thiện quy trình kỹ 8 giờ trước khi sử dụng để tránh sai lệch thuật FISH trên TB phôi sinh thiết từ nồng độ muối và pH. Nếu sai hỏng sẽ dẫn các phôi dƣ. đến quá trình lai tín hiệu huỳnh quang Sử dụng kỹ thuật FISH để xác định những không thành công. bất thường NST đã được thực hiện ở nhiều Một chú ý nữa là khi bóc lam men ra trung tâm nghiên cứu trên thế giới. Chúng khỏi lam kính cần bóc nhẹ nhàng, tránh tôi sử dụng bộ kít Vysis MultiVysion đã làm mất TB phôi nếu TB phôi dính vào thương mại hóa và được nhiều trung tâm lamen. Keo gắn lamen phải đúng hang, nghiên cứu trên thế giới sử dụng. sau khi gắn d dàng bóc ra sau lai, dung Đối với quá trình chuẩn hóa quy trình dịch lai không bị bay hơi sau khi ủ trong FISH, sinh thiết từ các mẫu phôi dư được buồng lai. tổng số 58 TB phôi (có TB phôi ngày 3 và Trong quá trình tiến hành kỹ thuật TB phôi ngày 5). FISH để chuẩn hóa quy trình trên 53/58 Trước khi bước vào thực hiện kỹ thuật TB phôi sinh thiết từ các phôi dư, có 3/50 FISH để chuẩn hóa quy trình, tiến hành TB phôi không đưa ra được kết luận có thử thao tác cố định TB lên lam kính đối hay không có lệch bội NST do tín hiệu với 5 TB phôi. Trong quá trình thao tác lai xấu; còn lại 50/58 TB phôi có tín hiệu trên 5 TB phôi, 3/5 TB bị bong do nguyên huỳnh quang phân tích được, kết quả FISH nhân: lam kính sử dụng chưa đủ sạch như sau: bình thường: 29 TB (58%); bất nên TB khó bám dính vào lam, quá trình thường: 21 TB (42%). nhỏ dung dịch cố định là carnoy quá Đối với 50 mẫu TB phôi thu được kết nhanh và nhiều. Sau khi rút kinh nghiệm, quả lai, 21 mẫu cho tín hiệu bất thường đã cố định được 2/5 TB phôi còn lại. ở các cặp NST 13, 18, 21, X, Y. Như vậy, 55
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 tỷ lệ lệch bội NST cao, chiếm tới 42% Kết quả của chúng tôi tương đồng với tổng số phôi được chẩn đoán. Còn lại 29 nghiên cứu của Munné, Sandalinas và mẫu phôi cho kết quả chẩn đoán bình Cohen thực hiện trên 1.600 phôi: hầu hết thường với các cặp NST đang đánh giá dị bội NST xuất hiện ở các cặp NST 21, chiếm 58%. 22, 16, 15; trong khi các cặp NST giới tính Nghiên cứu của Munné và CS (2007) 13, 18 ít gặp hơn [6]. thực hiện trên 6.000 phôi, kết quả: 56% BN Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ lệch nữ < 35 tuổi với phôi có hình thái tốt ở giai bội NST trên phôi bào khá cao ở các cặp đoạn phân chia có tỷ lệ bất thường về NST, NST 13, 18, 21, X, Y. Do vậy, cần sàng tỷ lệ này tăng theo độ tuổi người mẹ [6]. lọc những bất thường này trước chuyển phôi nhằm hạn chế trẻ sinh ra mang dị tật Nghiên cứu của Rubio và CS (2013) bẩm sinh, đặc biệt là nhóm có nguy cơ cao. sử dụng kỹ thuật FISH 9 đầu dò 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22 và XY nghiên cứu trên Chúng tôi thu được một số hình ảnh lai 265 phôi ngày 3 của 91 phụ nữ không có như sau: phôi làm tổ liên tiếp (tuổi trung bình 35,2), kết quả: tỷ lệ lệch bội NST là 57,3% [5]. Nguy n Thị Hương và CS nghiên cứu 127 phôi ngày 3 bằng kỹ thuật FISH 5 đầu dò, kết quả: tỷ lệ lệch bội NST là 46,4% [1]. Như vậy, kết quả về tỷ lệ lệch bội của chúng tôi khác với một số tác giả khác, do khác về việc chọn mẫu nghiên cứu, số lượng mẫu và số lượng NST được đánh giá trong mỗi nghiên cứu. (a) Bảng 1: Các dạng bất thường thu được sau khi phân tích kết quả lai. Hội chứng Số ƣợng Tỷ lệ % Patau 4 19,0 Edwards 2 9,5 Down 7 33,3 Turner 1 4,8 Klinefelter 1 4,8 Bất thường khác 6 28,6 Tổng số 21 100 (b) Hình 1: Kết quả FISH của các phôi bào Kết quả phân tích trên 50 TB phôi: tỷ lệ E8 và E30 không có bất thường ở cặp phôi cho kết quả trisomy 21 cao nhất (33,3%), NST 13, 18, 21 và cặp NST giới tính. tiếp đến là tỷ lệ phôi trisomy 13 (19%), (a) Phôi E8 có cặp NST giới tính XX; NST 18 và NST giới tính ít gặp bất thường. (b) Phôi E30 có cặp NST giới tính XY. 56
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Phân tích dưới kính hiển vi huỳnh bất thường về số lượng các cặp NST 13, quang thấy: 2 tín hiệu màu đỏ (red) ứng 18, 21, X, Y. với 2 NST 13, 2 tín hiệu màu xanh lá cây Sau khi chính thức đưa quy trình FISH (green) ứng với 2 NST 21, 2 tín hiệu màu đã chuẩn hóa vào chẩn đoán tiền làm tổ xanh lơ (aqua) ứng với 2 NST 18. Bên ở phôi của BN thực hiện IVF, những phôi cạnh đó, tín hiệu màu xanh da trời (blue) được chẩn đoán bằng FISH có kết quả ứng với NST X và tín hiệu màu vàng bình thường, sẽ được cấy chuyển vào tử (gold) ứng với NST Y. Như vậy, với phôi cung người mẹ. Điều đó giúp tăng khả (a) cặp NST giới tính là XX vì có 2 tín năng mang thai của bà mẹ và trẻ sinh ra hiệu màu xanh da trời (blue), phôi (b) cặp được khỏe mạnh. NST giới tính là XY vì có 1 tín hiệu màu Trong các phôi bào chúng tôi phân tích xanh da trời (blue) và 1 tín hiệu màu vàng bằng kỹ thuật FISH, ngoài những phôi (gold). Như vậy, với các phôi bào có số bào có kết quả bình thường đối với cặp lượng tín hiệu thu được giống như trên, NST 13, 18, 21, X, Y, chúng tôi còn thu kết quả chẩn đoán đưa ra sau khi tiến được một số hình ảnh phôi bất thường hành kỹ thuật FISH là phôi bào không có như sau: Hình 2: Kết quả FISH phôi bào E2 mang Hình 3: Kết quả FISH của phôi bào E38 3 NST ở các cặp NST 13, 18, 21 và mang 3 NST số 21. NST giới tính X. Quan sát phân tích thấy phôi bào ở hình 2 có 3 tín hiệu màu đỏ (red), 3 tín hiệu màu xanh lá cây (green), 3 tín hiệu màu xanh lơ (aqua) và 3 tín hiệu với màu xanh da trời (blue). Như vậy, TB phôi này có 3 NST 13, 3 NST 18, 3 NST 21 và cặp NST giới tính là XXX. TB phôi trên hình 3 có 2 tín hiệu màu xanh lơ, 2 tín hiệu màu đỏ, 2 tín hiệu màu xanh da trời và 3 tín hiệu màu xanh lá cây. Như vậy, phôi bào có bất thường ở NST 21, có tới 3 NST 21. Trẻ sinh ra sẽ mắc hội chứng Down. 57
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Hình 4: Kết quả FISH của phôi bào E24 Hình 5: Kết quả FISH của phôi bào E18 mang 3 NST số 13. mang 3 NST 18. TB phôi ở hình 4 ngoài 2 tín hiệu màu xanh lá cây, 2 tín hiệu màu xanh lơ, 1 tín hiệu màu xanh da trời, 1 tín hiệu màu vàng và 3 tín hiệu màu đỏ. Chứng tỏ phôi bào này có bất thường vì có tới 3 NST 13. Trẻ sinh ra sẽ mắc hội chứng Patau. Trong hình ảnh lai của TB phôi trên hình 5, ngoài 2 tín hiệu màu xanh lá cây, 2 tín hiệu màu đỏ, 1 tín hiệu màu xanh da trời và 1 tín hiệu màu vàng có tới 3 tín hiệu màu xanh lơ. Chứng tỏ phôi bào này có tới 3 NST 18. Trẻ sinh ra sẽ mắc hội chứng Edwards. Hình 6: Kết quả FISH của phôi bào E40 Hình 7: Kết quả FISH của phôi bào E48 mang cặp NST giới tính XO. mang cặp NST giới tính XXY. TB phôi ở hình 6 thu được tín hiệu lai gồm: 2 tín hiệu màu xanh lá cây, 2 tín hiệu màu đỏ, 2 tín hiệu màu xanh lơ, 1 tín hiệu màu xanh da trời. Chứng tỏ phôi bào này có cặp NST giới tính là XO. Trẻ sinh ra sẽ mắc hội chứng Turner. Phôi bào ở hình 7 cho kết quả lai có 2 tín hiệu với màu xanh lá cây, đỏ, xanh lơ, xanh da trời và 1 tín hiệu với màu vàng. Chứng tỏ có cặp NST giới tính là XXY. Trẻ sinh ra sẽ mắc hội chứng Klinefelter. 58
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 KẾT LUẬN trong sàng lọc một số bệnh lệch bội NST cho chẩn đoán di truyền tiền làm tổ. Tạp chí Phụ sản. Đã chuẩn hóa được quy trình kỹ thuật 2014, 12, tr.176-178. FISH đối với TB phôi dư ở người nhằm 2. Blancato JK. Fluorescence in situ chẩn đoán lệch bội NST ở các cặp NST số hybridization. The Principles of clinical 13, 18, 21, X và Y. Quy trình gồm 4 bước cytogenetics. Humana Press, New Jersey. 1999, với những thao tác đã được chuẩn hóa bảo pp.443-471. đảm phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, cho kết quả có độ chính xác cao. 3. Griffin DK. Dual fluorescent in situ hybridization for simultaneous detection of Áp dụng quy trình đã hoàn thiện trên X and Y chromosome-specific probes for the 50 mẫu TB phôi cho thấy, tỷ lệ lệch bội sexing of human preimplatation embryonic NST cao chiếm tới 21/50 (42%) tổng số cuclei. Human Genetic. 1992, 89, pp.18-22. phôi được chẩn đoán. Do vậy, cần sàng lọc các bất thường này trước chuyển phôi 4. Lim HJ et al. Amniotic fluid interphase nhằm hạn chế trẻ sinh ra mang dị tật bẩm fluorescence in situ hybrization (FISH) for sinh, đặc biệt là nhóm có nguy cơ cao. detection of aneuploidy; Experiences in 130 prenatal cases. J Korean Med Sci. 2002, 17, KHUYẾN NGHỊ pp.89-92. Trên thực tế, do kỹ thuật FISH còn có 5. Rubio C, Bellver J, Rodrigo L et al. hạn chế là chỉ đánh giá được một số NST Preimplantation genetic screening using nhất định. Vì vậy, để có được kết quả fluorescence in situ hybridization in patients chẩn đoán di truyền toàn diện nhất đối với with repetitive implantation failure and advanced các phôi trước khi cấy chuyển, cần kết maternal age: two randomized trials. Fertility hợp kỹ thuật FISH với những kỹ thuật and Sterility. 2013, 99, pp.1400-1407. chẩn đoán khác, phù hợp với từng trường 6. Munne, Sandalinas M, Cohen J. hợp cụ thể. Chromosome abnormalities in human embryos. In textbook of Assited Reprodutive Techniques TÀI LIỆU THAM KHẢO Laboratory and Clinical Perspectives (Eds) 1. Hoàng Thị Hương, Nguyễn Viết Tiến, Gardner DK, Weissman A, Howles CM and Đặng Thu Hằng. Ứng dụng kỹ thuật FISH Shoham Z. 2001, pp.297-318. 59