Hiệu quả của phương pháp ly tâm phân lớp tỷ trọng phân lập tế bào gốc tủy xương sử dụng cho điều trị một số tổn thương xương và khớp

Nội dung text: Hiệu quả của phương pháp ly tâm phân lớp tỷ trọng phân lập tế bào gốc tủy xương sử dụng cho điều trị một số tổn thương xương và khớp

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013 HIỆU QUẢ CỦA PHƢƠNG PHÁP LY TÂM PHÂN LỚP TỶ TRỌNG PHÂN LẬP TẾ BÀO GỐC TỦY XƢƠNG SỬ DỤNG CHO ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ TỔN THƢƠNG XƢƠNG VÀ KHỚP Dương Văn Toàn*; Lý Tuấn Khải** Tãm t¾t Nghiên cứu này nhằm đánh giá hiệu quả quy trình thu gom, chiết tách khối tế bào gốc (TBG) từ dịch tủy xương bằng phương pháp ly tâm theo phân lớp tỷ trọng tế bào. 126 bệnh nhân (BN) khớp giả (KG), chậm liền xương (CLX) thân xương dài, BN ngắn chi và mất đoạn chi điều trị kéo dài chi theo nguyên lý Ilizarov hết giai đoạn căng giãn, BN hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi giai đoạn I, II (theo ARCO), mỗi BN được chọc hút lấy 250 ml dịch tủy xương từ xương chậu, tách lấy thành phần tế bào đơn nhân bằng phương pháp ly tâm gradient tỷ trọng với dung dịch ficoll tỷ trọng 1,077 g/l. Kết quả: thể tích khối TBG tủy xương thu được là 32,19 ± 5,62 ml, số lượng tế bào có nhân 49,08 ± 30,79 G/L, tế bào đơn nhân chiếm đa số (57,38 ± 13,86%); đậm độ tế bào gốc CD 34+ là 16,98 ± 9,89 G/L; tỷ lệ giữ tế bào đơn nhân và tế bào CD 34+ tương ứng 34,89 ± 12,05% và 55,96 ± 30,46%; đậm độ tế bào CD 34+ tăng 5,67 ± 3,15 lần; tỷ lệ loại bỏ hồng cầu và huyết sắc tố tương ứng 99,60 ± 0,48% và 99,32 ± 0,41%. * Từ khóa: Tế bào gốc tủy xương; Khớp giả; Chậm liền xương; Ly tâm phân lớp tỷ trọng. EFFICACY OF GRADIENT DENSITY CENTRIFUGATION METHOD IN ISOLATING BONE MARROW STEM CELLS FOR TREATMENT OF CERTAIN INJURED BONES AND JOINTS Summary The aims of this study was to assess the efficacy of the gradient density centrifugation method in isolating bone marrow stem cells (BMSC). 126 patients with nonunion long bones, shortened limbs, aseptic femoral head osteonecrosis staged I, II (ARCO) were enrolled. 250 ml bone marrow fluid was aspirated from the pelvis of every patient. Mononuclear cells were separated by the gradient density centrifugation method using Ficoll solution 1.077. Results: Final BMSC suspension volume was 32.19 ± 5.62 ml, the suspension cells concentration was 49.08 ± 30.79 G/L with 57.38 ± 13.86% mononuclear cells; CD 34+ cell concentration was 16.98 ± 9.89 G/L; mononuclear cells and CD 34+ cells recovering ratio were 34.89 ± 12.05% and 55.96 ± 30.46%, respectively; CD 34+ cell concentration increased 5.67 ± 3.15 times; RBC and hemoglobin removing ratio were 99.60 ± 0.48% and 99.32 ± 0.41%, respectively. * Key words: Bone marrow stem cell; Nonunion bone; Shortened limbs; Gradient density centrifugation. * Trường Đại học Y Hà Nội ** BÖnh viÖn TWQĐ 108 Ng•êi ph¶n håi (Corresponding): Lý Tuấn Khải (lytuankhai108@gmail.com) Ngµy nhËn bµi: 31/7/2013; Ngµy ph¶n biÖn ®¸nh gi¸ bµi b¸o: 10/9/2013 Ngµy bµi b¸o ®•îc ®¨ng: 23/9/2013
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ thương Chỉnh hình - Bệnh viện Việt Đức từ tháng 01 - 2008 đến 03 - 2011. Sử dụng TBG, TBG tạo máu trong điều trị là một hướng đang được tập trung 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. nghiên cứu và đã thu được kết quả rất bất * Thiết kế nghiên cứu: tiến cứu mô tả cắt ngờ không chỉ trong điều trị bệnh của tổ ngang. chức tạo máu mà còn trong nhiều bệnh của * Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu: các cơ quan tổ chức khác với mục đích - Kỹ thuật thu gom dịch tủy xương: thu phục hồi, tái tạo tổ chức. Các TBG tạo máu gom dịch tủy xương bằng phương pháp của tủy xương cũng như của máu tuần chọc hút qua da, dưới gây tê tủy sống. Tiến hoàn được nghiên cứu rất sâu và ứng dụng hành thủ thuật tại phòng mổ trong điều kiện rộng rãi trong lâm sàng với kết quả tốt. Đã vô khuẩn. Vị trí chọc hút là gai chậu sau có một số nghiên cứu chứng minh bằng cấy trên, tổng số dịch tủy xương lấy 250 ml. ghép TBG tủy xương tự thân có thể điều trị - Kỹ thuật tách chiết, cô đặc TBG từ dịch thành công những trường hợp gãy xương tủy xương: bằng phương pháp ly tâm theo không liền, mất đoạn xương cũng như tái phân lớp tỷ trọng tế bào, pha loãng dịch tủy tạo các mô xương bị hoại tử trên người. xương theo tỷ lệ 6:1 với dung dịch đệm Dịch tủy xương có chứa TBG với số lượng (nước muối sinh lý hoặc dung dịch PBS, hạn chế, còn lại đa số là tế bào đang 6V dịch tủy xương + 1V dung dịch đệm). trưởng thành hoặc đã trưởng thành không tách thành phần tế bào đơn nhân (MNC) có vai trò trong tạo xương. Vì vậy, để đạt dịch tủy xương (trong đó có chứa TBG) yêu cầu điều trị, dịch tủy xương sau khi thu bằng cách ly tâm theo gradient tỷ trọng sử gom được xử lý cô đặc để tập trung số dụng dung dịch ficoll tỷ trọng 1,077 g/cm3, lượng TBG với đậm độ cần thiết cho quá huyền dịch khối TBG này trong 30 ml nước trình liền xương và loại bớt các thành phần muối sinh lý. tế bào đã trưởng thành. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu: Đánh - Kỹ thuật xác định thành phần và chất giá hiệu quả quy trình thu gom, chiết tách lượng khối TBG: khối TBG từ dịch tủy xương bằng phương + Đếm số lượng tế bào có nhân và pháp ly tâm theo phân lớp tỷ trọng tế bào thành phần tế bào bằng máy huyết học tự trong điều trị một số tổn thương xương, động CELL-DYN 1800 (Abbott, Hoa Kỳ) kết khớp khó hồi phục. hợp với phương pháp tế bào học kinh điển. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP + Xác định TBG tạo máu bằng kỹ thuật + NGHIÊN CỨU đếm số lượng tế bào CD34 trên thiết bị phân tích tế bào dòng chảy FACS-Calibur 1. Đối tƣợng nghiên cứu. (Hoa Kỳ) với phần mềm CellQuest theo quy 126 BN KG, CLX thân xương dài, BN trình ISHAGE, sử dụng bộ sinh phẩm của ngắn chi và mất đoạn chi dưới điều trị kéo hãng Becton - Dickinson (Hoa Kỳ). dài chi theo nguyên lý Ilizarov hết giai đoạn * Thu thập và xử lý số liệu: phân tích và căng giãn, BN hoại tử vô khuẩn chỏm xử lý bằng chương trình thống kê SPSS 18.0. xương đùi giai đoạn I, II (theo ARCO), BN tuổi từ 15 - 66 được điều trị bằng ghép TBG tủy xương tại Viện Chấn thương Chỉnh KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ hình, Bệnh viện TWQĐ 108 và Viện Chấn BÀN LUẬN
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013 Bảng 1: Đặc điểm BN nghiên cứu (n = 126). kim lấy tủy, tất cả 126 BN đều được lấy tủy xương ở gai chậu sau trên hai bên. Do vậy, Tuæi Nam (n = 95) N÷ (n = 31) p tư thế bệnh nhân đều đặt nằm sấp. Một số Trung 37,70 ± 11,98 35,56 ± 11,97 > 0,05 tác giả đã ứng dụng ghép trực tiếp tủy bình ± SD 36,52 ± 12,26 xương vào ổ CLX, KG thân xương chày với Trong tổng số 126 khối TBG của BN thể tích thay đổi khác nhau. Healey (1990) nghiên cứu, 95 khối TBG được tách từ BN [7] ghép trung bình 50 ml tủy xương để điều nam và 31 khối TBG từ BN nữ. Nghiên cứu trị BN bị CLX, KG sau lấy u xương chày. tiến hành ở 126 bệnh nhân có tuổi trung Connolly (1991) [4] ghép từ 100 - 150 ml bình 36,52 ± 12,26, tuổi trung bình của BN ở hai nhóm nghiên cứu khác nhau không có tủy xương cho 20 trường hợp KG xương ý nghĩa thống kê (p > 0,05). BN nhỏ tuổi chày. Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu ghép nhất 15 và cao nhất 66 tuổi; bao gồm 69 BN tủy xương sau khi tách khối TBG để điều trị KG, CLX thân xương dài, 29 BN ngắn chi CLX, KG trên lâm sàng. Hernigou (2006) [8] và mất đoạn chi dưới điều trị kéo dài chi lấy trung bình 306 ml tủy xương trước khi theo nguyên lý Ilizarov hết giai đoạn căng giãn, 28 BN hoại tử vô khuẩn chỏm xương tách. Do vậy, rất khó để chúng tôi có thể đùi giai đoạn I, II (theo ARCO), những BN tham khảo lấy bao nhiêu dịch tủy xương ở này được điều trị bằng ghép TBG tủy người Việt Nam trưởng thành khỏe mạnh là xương. BN được chẩn đoán bệnh dựa trên vừa đủ để đạt hiệu quả liền xương tối ưu. các tiêu chuẩn về lâm sàng và cận lâm Chúng tôi thấy thông thường một người sàng theo từng mặt bệnh tương ứng. trưởng thành, khỏe mạnh có thể cho một Bảng 2: Các chỉ số tế bào của dịch tủy đơn vị máu (250 ml) trong khoảng thời gian xương trước tách ở BN nghiên cứu (n = 126). 10 - 15 phút vẫn bình thường, không ảnh Gi¸ trÞ Gi ¸ trÞ Gi¸ trÞ Đ¬n ChØ sè thÊp cao trung b×nh hưởng đến lao động, sinh hoạt. Tương tự, vÞ nhÊt nhÊt SD nếu một BN không có bệnh mạn tính hoặc Thể tích dịch 320,69 không bị thương tổn nặng kèm theo, khi tủy xương ml 290,00 340,00 12,49 trước tách mất khoảng 200 - 250 ml máu cơ thể vẫn Số lượng tế bào thích nghi được và có thể bù trừ bằng dung có nhân trong G/L 6,10 36,60 18,53 5,65 dịch cao phân tử... mà không ảnh hưởng dịch tủy xương đến huyết động. Hơn nữa, với một thể tích Tỷ lệ MNC % 27,20 54,10 39,88 5,94 dịch tủy xương đủ lớn, hy vọng sẽ có đủ số Tỷ lệ GRAN % 45,90 72,80 59,48 5,76 lượng TBG cần thiết. Vì vậy, chúng tôi lấy RBC T/L 2,05 4,51 3,86 0,48 một thể tích dịch tủy xương chung cho tất HGB g/L 61,00 127,00 117,76 13,87 cả 101 BN là 250 ml. Mọi BN đều được PLT G/L 25,00 343,00 162,57 99,02 truyền dịch trong quá trình lấy tủy xương Lấy dịch tủy xương: qua thăm khám cho như huyết thanh mặn 0,9% hoặc Hes 6%. thấy đa phần xương chậu của BN không Qua theo dõi trong và sau khi lấy tủy quá to, phần gai chậu trước trên không dày, tiên lượng có thể gặp khó khăn khi chọc
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013 xương, không gặp trường hợp nào bị tai xương trước tách là 18,53 5,65 G/L, MNC biến như sốc hay tụt huyết áp. chiếm 39,88 5,94%, số lượng hồng cầu Ở 126 BN trong nghiên cứu này cho và lượng huyết sắc tố lần lượt là 3,86 thấy số lượng tế bào có nhân trong dịch tủy 0,48 triệu/l, 117,76 13,87 g/l. Bảng 3: Tỷ lệ và số lượng tuyệt đối tế bào CD34+ trong dịch tủy trước tách ở BN nghiên cứu (n = 126). Ьn Gi¸ trÞ Gi¸ trÞ Gi¸ trÞ ChØ sè vÞ thÊp nhÊt cao nhÊt trung b×nh SD Tỷ lệ tế bào CD34+ % 0,17 1,19 0,55 0,19 Số lượng tế bào CD34+/ml dịch tủy xương x106 0,02 0,28 0,10 0,04 Số lượng tế bào CD34+ trong dịch tủy xương x106 7,03 88,70 33,25 17,28 Bảng 4: Các chỉ số tế bào của khối TBG tách ở BN nghiên cứu (n = 126). Gi¸ trÞ Gi¸ trÞ Gi¸ trÞ ChØ sè Ьn vÞ thÊp nhÊt cao nhÊt trung b×nh SD Thể tích khối tế bào gốc ml 21,00 55,00 32,19 5,62 Số lượng tế bào có nhân của khối TBG G/L 10,80 225,20 49,08 30,79 Tỷ lệ MNC % 27,00 84,60 57,38 13,86 Tỷ lệ GRAN % 15,40 73,00 42,67 14,03 RBC T/L 0,03 1,14 0,12 0,02 HGB g/L 2,00 24,00 6,04 3,17 PLT G/L 44,00 1023,00 353,48 236,58 Dịch tủy xương được tách thành phần khối TBG tủy xương, số lượng tế bào có tế bào đơn nhân bằng cách ly tâm theo nhân trung bình 44,5 ± 26,0 g/l, số lượng tế gradient tỷ trọng sử dụng dung dịch ficoll. bào đơn nhân trong khối trung bình 25,0 ± Trong 32,19 ± 5,62 ml khối TBG tủy xương 14,6 g/l. Nhiều tác giả khác cho rằng nên sau khi tách bằng phương pháp ly tâm theo tách và cô đặc tủy xương trước khi ghép để loại bỏ những tế bào không cần thiết cho tỷ trọng tế bào và cô đặc, số lượng tế bào quá trình liền xương cũng như làm tăng mật có nhân là 49,08 30,79 g/l, tế bào đơn độ TBG tạo xương trong dịch ghép. Kết quả nhân chiếm đa số (57,38 13,86%). Kết này cho thấy hiệu quả của việc tách khối quả của chúng tôi tương tự nghiên cứu của khối TBG tủy xương, đã loại được những tế Nguyễn Mạnh Khánh [2] ở 65 BN CLX, bào không cần thiết do các TBG nằm trong KG thân xương chày, sau khi tách và cô đặc khối tế bào đơn nhân này. Bảng 5: Tỷ lệ và số lượng tuyệt đối tế Gi¸ trÞ Gi¸ trÞ Gi¸ trÞ Đ¬n + ChØ sè thÊp cao trung b×nh bào CD34 trong khối TBG ở BN nghiên vÞ nhÊt nhÊt SD cứu (n = 126). Tỷ lệ tế bào % 0,14 4,76 1,22 0,65
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013 + CD34 Tỷ lệ giữ CD 55,96 + % 58,25 250,27 Số lượng tế 34 30,46 + 6 bào CD34 /ml x10 0,06 2,03 0,54 0,30 + Tăng CD 34 5,67 khối TBG Lần 0,7 25,83 trong 1 ml 3,15 Số lượng tế bào CD34+ x106 1,98 62,85 16,96 9,89 trong khối TBG Tỷ lệ giữ lại tế bào MNC khi tách TBG từ dịch tủy xương bằng phương pháp ly tâm + Tỷ lệ tế bào CD 34 trong khối TBG tách theo tỷ trọng tế bào là 34,89 12,05%. bằng phương pháp ly tâm theo tỷ trọng tế Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của bào là 1,22 0,65%. Nghiên cứu 65 BN CLX, Nguyễn Mạnh Khánh [2]: tỷ lệ % tế bào KG thân xương chày, một số tác giả thấy + tỷ lệ tế bào CD34+ trung bình 1,3 ± 0,5% CD34 trong khối TBG tủy xương sau (0,3 - 3,1%). Nồng độ tế bào CD34+/ml khối khi tách tăng gấp hơn 2 lần so với trước TBG tủy xương là 0,5 ± 0,2 g/l. Tổng số khi tách (trước tách 0,6 ± 0,2%, sau tách lượng tế bào CD34+ khối TBG trung bình 1,3 ± 0,5%). 6 13,8 ± 5,3 x 10 . Connolly (1989) [4] đánh giá hiệu quả Bảng 6: Tỷ lệ loại bỏ các tế bào bạch tạo xương khi ghép tủy xương đơn thuần cầu hạt (GRAN), hồng cầu, huyết sắc tố và và tủy xương cô đặc đã qua ly tâm vào tiểu cầu ở BN nghiên cứu (n = 126). khoang phúc mạc và ổ chậm liền xương. Với cùng một thể tích ghép, kết quả cho Gi¸ trÞ Gi¸ trÞ Gi¸ trÞ Đ¬n ChØ sè thÊp cao trung b×nh thấy quá trình tạo xương được thúc đẩy khi vÞ nhÊt nhÊt SD ghép tủy xương đã qua ly tâm, nhưng Tỷ lệ loại % 38,00 97,68 80,83 13,49 không xảy ra khi ghép tủy xương chưa qua GRAN xử lý. Tại các khoang được ghép tủy Tỷ lệ loại hồng % 95,96 99,92 99,60 0,48 cầu xương, sau ly tâm, mức độ canxi lắng đọng Tỷ lệ loại huyết nhiều hơn so với ghép tủy toàn bộ (193% % 96,31 99,83 99,32 0,41 sắc tố so với 101%). Tại ổ gãy chậm liền xương, Tỷ lệ loại tiểu % 35,54 95,42 52,79 40,68 tạo xương tốt hơn cả về mặt hoá sinh và cơ cầu học. Trên phim X quang 5 tuần sau ghép, Khi tách bằng phương pháp ly tâm theo quá trình liền xương cải thiện rõ rệt ở nhóm tỷ trọng tế bào, tỷ lệ loại bỏ bạch cầu hạt được ghép tủy xương đã qua ly tâm. Theo (GRAN) là 80,83 13,49%. Đây là những tác giả, sự khác biệt này do sau khi ly tâm thành phần không cần thiết trong khối TBG. mật độ TBG trong tủy xương ghép tăng lên Như vậy, tỷ lệ loại bỏ các thành phần trên khiến quá trình tạo xương mới được cải tương đối cao. thiện hơn. + Bảng 7: Tỷ lệ giữ lại tế bào CD 34 ở BN KẾT LUẬN nghiên cứu (n = 126). Qua nghiên cứu quy trình thu gom, chiết Gi¸ trÞ Gi¸ trÞ Gi¸ trÞ Đ¬n ChØ sè thÊp cao trung tách khối TBG từ dịch tủy xương bằng vÞ nhÊt nhÊt b×nh SD phương pháp ly tâm theo tỷ trọng tế bào ở 34,89 126 BN tổn thương xương, khớp khó hồi Tỷ lệ giữ MNC % 7,70 68,79 12,05 phục, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013 - Thể tích khối TBG tủy xương thu được 7. Healey JH, Zimmerman PA, McDonnell 32,19 ± 5,62 ml, số lượng tế bào có nhân JM, Lane JM. Percutaneous bone marrow 49,08 ± 30,79 g/l, trong đó tế bào đơn nhân grafting of delayed union and nonunion in cancer patients. Clin Orthop. 1990, 256, pp.280-285. chiếm đa số (57,38 ± 13,86%). + 8. Hernigou P, Mathieu G., Poignard A, - Tỷ lệ tế bào CD 34 của khối TBG tủy Manicom O, Beaujean F, Rourd H. Percutaneous xương là 1,22 ± 0,65%, số lượng tế bào autologous bone-marrow grafting for nonunions. + gốc CD 34 là 16,98 ± 9,89 g/l. Surgical technique. J Bone Joint Surg. 2006, - Tỷ lệ giữ tế bào đơn nhân và tế bào 88A, Suppl 1, pp.322-327. CD 34+ tương ứng là 34,89 ± 12,05% và 55,96 ± 30,46%; sau chiết tách, đậm độ tế bào CD 34+ tăng 5,67 ± 3,15 lần. - Tỷ lệ loại bỏ bạch cầu hạt, hồng cầu, huyết sắc tố và tiểu cầu lần lượt là 80,83 13,49%, 99,60 ± 0,48%, 99,32 ± 0,41% và 52,79 40,68%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Thị Thu Hà. TBG và khả năng sử dụng TBG trong điều trị. Y học Việt Nam số đặc biệt, 2004, 302 (9), tr.3-20. 2. Nguyễn Mạnh Khánh. Nghiên cứu ứng dụng ghép TBG tủy xương tự thân điều trị CLX, KG thân xương chày. Luận án Tiến sỹ Y học. 2010. 3. Brazelton T, Rossi FM, Keshet GI, Blau HM. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. Science. 2000, 290, pp.1775-1779. 4. Connolly JF, Guse R, Lippiello L, Dehne R. Development of an osteogenic bone marrow preparation. J Bone Joint Surg. 1989, 71A, pp.684-691. 5. Edelberg JM, Tang L, Hattori K, Lyden D, Rafii S. Young adult bone marrowderived endothelial precursor cells restore aging- impaired cardiac angiogenic function. Circ Res. 2002, 90, E89-E93. 6. Grant MB, May WS, Caballero S et al. Adult hematopoietic stem cells provide functional hemangioblast activity during retinal neovascularization. Nat Med. 2002, 8, pp.607-612.
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013