Hai hợp chất alcaloid phân lập từ cây dây đau xương (tinospora sinensis (lour.) merr) trồng tại tỉnh Vĩnh Phúc

Nội dung text: Hai hợp chất alcaloid phân lập từ cây dây đau xương (tinospora sinensis (lour.) merr) trồng tại tỉnh Vĩnh Phúc

1. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 56-61 Hai hợp chất alcaloid phân lập từ cây Dây đau xương (Tinospora sinensis (Lour.) Merr) trồng tại tỉnh Vĩnh Phúc Vũ Đức Lợi1,*, Nguyễn Thị Mai Trang1, Trương Thị Vân Hoài1, Nguyễn Thúc Thu Hương1, Nguyễn Thành Nam2 1Khoa Y Dược, Đai học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam 2Khoa Dược, Bệnh viện quân y, 7A, 466 Nguyễn Trãi, Quận 5, Hồ Chí Minh, Việt Nam Nhận ngày 03 tháng 5 năm 2017 Chỉnh sửa ngày 24 tháng 7 năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 06 tháng 12 năm 2017 Tóm tắt: Cây dây đau xương (Tinospora sinensis (Lour.) Merr) được trồngở Vĩnh phúc là một trong những cây thuốc phổ biến và có giá trị sử dụng cao trong đời sống. Trong chương trình nghiên cứu và phát triển dược liệu, trên cơ sở sử dụng các phương pháp sắc kí đã phân lập được hai hợp chất từ cây dây đau xương thu hái ở Vĩnh Phúc. Câu trúc hóa học của hai hợp chất này được xác định làdecarin (1) và iwamid (2) dựa trên các dữ liệu phổ khối lượng và cộng hưởng từ hạt nhân kết hợp so sánh với dữ liệu phổ được công bố trong tài liệu tham khảo. Đây là công bố đầu tiên về thành phầnbenzophenanthridine của cây dây đau xương trồng ở Việt Nam. Từ khóa: Dây đau xương, Tinospora sinensis, decarin, iwamid. 1. Đặt vấn đề cây Dây đau xương có chứa một số nhóm chất như: chứa steroid, flavonoid, alkaloid, Cây Dây đau xương (Tinospora sinensis glycoside, một sốhợp chất như: Magnoflorine, (Lour.) Merr), còn được gọi là khoan cân đằng, berberine, tinosporicide, menispermacide, là loài thực vật sống lâu năm thuộc họ tiết dê palmatine, (+) - malabarolide và tinosinen Menispermaceae [1]. Ở Việt Nam, cây mọc I,tinosposide A và B tinosposide [5-8]. Tuy nhiều ở vùng Tây bắc, mọc hoang khắp nơi ở nhiên, ở nước ta cho đến nay có rất ít nghiên miền núi cũng như các đồng bằng [1]. Trong y cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học học cổ truyền, thân cây dây đau xương được sử của dược liệu dây đau xương. Vì vậy, cần có dụng chữa sốt, phong thấp, chứng đau nhức gân các nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng cốt, đau dây thần kinh hông, đòn ngã tổn sinh học để bổ sung them dữ liệu về loài cây thương và để bồi bổ sức khỏe. Lá tươi cũng này, giúp sử dụng hiệu quả hơn. dùng đắp chỗ đau nhức trong gân cốt và trị rắn Bài báo này trình bày về phân lập và xác cắn [2]. Các nghiên cứu khoa học hiện đại đã định cấu trúc hóa học của hai hợp chất chứng minh dây đau xương có tác dụng trong benzophenanthridin mới được phân lập từdây sốt rét, hạ sốt, kháng khuẩn, sát khuẩn, kháng u đau xương trồng tại Vĩnh Phúc, Việt Nam. và hoạt tính antiprotozoal (Leishmania) [3, 4]. Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy _______ 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Tác giả liên hệ. ĐT.: 84-917879959. Email: ducloi82@gmail.com 2.1. Đối tượng nghiên cứu 5 6
2. V.Đ. Lợi và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 56-61 57 Mẫu cây Dây đau xương được thu hái vào 1,5lít). Các dịch chiết n- hexane, ethylacetate tháng 1 năm 2017 tại thị trấn Tam Đảo, tỉnh được cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm thu Vĩnh Phúc. Mẫu thực vật đã được giám định tên được các cặn dịch chiết tương ứng n- hexan khoa học là: Tinospora sinensis (Lour.) Merr, (H32,4 g) và (E, 36,0 g) và lớp nước họ tiết dê Menispermaceae, mẫu được lưu giữ (N, 20,6 g). tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN. Cặn chiết ethylacetate (36,0g) được hòa tan với một lượng tối thiểu ethyl acetat sau đó tiến 2.2. Dung môi, hóa chất hành phân tách trên cột sắc ký silica gel pha Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân thường, rửa giải bằng hệ dung môi lập như methanol (MeOH), n-hexan, ethyl chloroform/methanol (20/1→ 1/1)thu được bốn acetat (EtOAc), và dicloromethan (DCM) đều phân đoạn chính E1 (9,6 g), E2(8,3 g), E3(6,1 đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất g), E4(4,2 g) lại trước khi dùng. Dung môi phân tích gồm Từ phân đoạn E1 tiếp tục phân tách trên cộtsilica gel pha thường với hệ dung môi MeOH, n-hexan, EtOAc, H2O dùng để phân tích sắc ký đều đạt tiêu chuẩn phân tích. Pha n-hexane/ethylacetate (2/1) thu được 4 phân tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel pha đoạn nhỏ E1.1(2,4g), E1.2(1,8g), E1.3(2,6g), thường (0,040 - 0,063 mm, Nicalai Tesque Inc., E1.4 (1,2 g). Phân đoạn nhỏ E1.1 được phân Nhật Bản), YMC ODS-A (50μm, YMC Co. tách tiếp trên cột sắc ký silicagel pha thường Ltd., Nhật Bản). Bản mỏng tráng sẵn trên đế với hệ dung môi rửa giải là chloroform nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F và pha /ethylacetate (3/1) thu được hợp chất L1 254 (10mg). Phân đoạn E1.3 được phân tách bằng đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức). Phát hiện chất bằng đèn tử sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dung môi n-hexane/n-butanol (3/1) thu được hợp chất L2 (12 mg) dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % hơ nóng để phát hiện vết chất. 2.3. Thiết bị, dụng cụ 3.Kết quả và bàn luận Điểm nóng chảy được đo trên máy Stuart 3.1. Hợpchất L1:Decarin SMP3 (Sanyo, Nhật Bản). Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1260 Series LC-MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một và hai chiều được đo trên máy JEOL ECX 400 (Jeol, Nhật Bản) và sử dụng dung môi CDCl3/CD3OD, chất nội chuẩn là tetramethylsilan (TMS). 2.4. Chiết tách và phân lập chất Mẫu cây phơi khô, nghiền thành bột (1,2kg), chiết trong methanol (3 lần x 3 lít), Hình 1. Cấu trúc hợp chất L1. bằng thiết bị chiết siêu âm (40oC,3h). Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gộp lại và cất loại dung Chất ở dạng tinh thể hình kim, màu vàng. môi ở áp suất giảm thuđược 108,0g cặn chiết Nhiệt độ nóng chảy: 242-245oC. methanol. Cặn chiết này được hòa tan vào một CTPT: C19H13NO4; KLPT M = 319. ít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt Số liệu phổ1 H-NMR và 13C-NMR (DMSO- với n-hexane và ethylacetate (mỗi loại 3 × d6) được trình bày ở Bảng 1.
3. 58 V.Đ. Lợi và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 56-61 Bảng 1. Số liệu phổ NMR của L1 và hợp chất tham khảo S Vị trí C δC δC DEPT δH (J=Hz) HMBC (H→C) 1 104,4 104,5 CH 7,53 (s) 2, 3, 4a 2 148,1 148,1 C - - 3 147,9 147,8 C - - 4 100,8 100,9 CH 8,52 (s) 3 4a 128,4 128,3 C - - 4b 138,7 138,6 C - - 6 145,7 145,8 CH 9,56 (s) 4b,6a, 10a 6a 121,4 121,6 C - - 7 142,1 142,1 C - - 8 147,5 147,5 C - - 9 123,5 123,6 CH 7,56 (d,8,5) 7, 10a 10 118,5 118,6 CH 8,47 (d,8,5) 6a, 8 10a 126,4 126,4 C - - 10b 120.0 119,9 C - - 11 118,5 118,7 CH 8,52 (d,9,0) 4b,10a,12,12a 12 127,0 127,0 CH 7,94 (d,9,0) 10b, 4a,1 12a 129,2 129,2 C - - -OCH2O- 101,4 101,4 CH2 6,20 (s) 2, 3 7-OCH3 61,1 61,2 CH3 4,01 (s) 7 8-OH - - 10,10 (s) 7, 8, 9 SδC của decarin đo trong DMSO [9]. Hợp chất L1 thu được dưới dạng tinh thể Trên phổ HMBC thấy có các tương tác giữa hình kim, màu vàng nâu và hiện màu vàng trên 8-OH (δH10,10) với C-7 (δC142,1)/C-8 bản TLC khi dùng thuốc thử Dragendorff cho (147,5)/C-9 (123,6); tương tác giữa các proton 1 thấy đây cũng là một alcaloid. Trên phổ H- của nhóm methoxy (OCH3) tại δH 4,01 với C-7 NMR của L1 xuất hiện tín hiệu của 7 proton (δC 142,1) cho phép khẳng định vị trí nhóm vòng thơm trong đó có: 1 nhóm methoxy tại δH hydroxy và methoxy lần lượt tại C-8 và C-7. So 4,01(s); 2 cặp tín hiệu dạng doublet tại δH 7,56 sánh dữ liệu phổ NMR của L1 hoàn toàn trùng (d,J=8,5Hz) và 8,48 (d,J=8,5Hz); 8,52 khớp với decarin [9]. Như vậy, L1 được xác (d,J=9,0Hz) và 7,94 (d,J=9,0Hz); 1 nhóm định chính xác là decarin. dioximethylen (-OCH2O-) tại δH 6,20(s); 1 3.2. Hợpchất 2 nhóm hydroxyl tại δH 10,10(s); 3 tín hiệu dạng singlet tại δ 7,53(s), 8,52(s) và 9,56(s). Phổ 13C- H Chất bột vô định hình, màu nâu. Nhiệt độ NMR và phổ DEPT xuất hiện tín hiệu của 19 nóng chảy:270-274oC. nguyên tử carbon trong đó có 1 carbonmethyl, 1 CTPT: C20H17NO6; KLPT M = 367. carbonmethylen, 7 carbonmethine và 10 carbon Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO- bậc bốn. Thông qua các tương tác trực tiếp H-C d ) được trình bày ở Bảng 2: trên phổ HSQC độ chuyển dịch hóa học của các 6 proton được gán với các carbon tương ứng.
4. V.Đ. Lợi và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 56-61 59 Bảng 2. Số liệu phổ NMR của L2 và hợp chất tham khảo # Vị trí C δC δC DEPT δH(J=Hz) HMBC (H→C) 1 99,8 98,6 CH 6,98 (s) 2, 3, 16 2 148,5 147,8 C - - 3 149,6 148,8 C - - 4 103,7 104,1 CH 7,45 (s) 3, 5,15 5 127,6 126,8 CH 7,80 (d,8,0) 13,16 6 128,5 127,7 CH 7,21 (d,8,5) 13,14,18 8 164,3 163,2 CH 7,95 (s) - 9 104,7 107,2 CH 6,36 (d,8,5) 10,18 10 149,7 150,1 C - - 11 137,7 135,5 C - - 12 153,6 147,5 C - - 13 135,5 134,6 C - - 14 136,7 135,4 C - - 15 129,4 128,0 C - - 16 131,7 130,4 C - - 17 123,8 124,6 CH 6,59 (d,8,0) 10,12,13 18 115,6 117,8 C - - N-CH3 33,0 32,7 CH3 2,88 (s) 8, 14 -OCH2O- 102,2 101,5 CH2 6,16 (d,2,5) 2, 3 10-OH - - 9,34(s) 11 11-OCH3 60,5 59,9 CH3 3,69 (s) 11 12-OH - 8,72(s) 18 # Giá trị δC của iwamid đo trong CDCl3 [10] Hình 2. Cấu trúc hợp chất L2. Hợp chất L2 thu được dưới dạng bột vô 6,36(d,J=8,5Hz) và 6,59 (d, J =8,0Hz); 1 nhóm định hình, màu nâu và hiện màu vàng trên bản N-methyl tại δH 2,88(s) tín hiệu của 1 nhóm TLC khi dùng thuốc thử Dragendorff cho thấy dioximethylen (-OCH2O-) tại δH 6,16(d, J = 1 đây cũng là một alkaloid. Phổ H-NMR của L2 2,5Hz); 1 proton của nhóm aldehyde tại δH xuất hiện tín hiệu của: 2 nhóm hydroxyl tại δH 7,95(s). 13 8,72(s) và 9,34 (s); 1 nhóm methoxy tại δH Phổ C-NMR và phổ DEPT của L2 xuất 3,69(s); 6 proton thuộc vòng thơm tại δH6,98 (s), hiện tín hiệu của 20 nguyên tử carbon trong đó 7,45(s), 7,21(d,J=8,5Hz), 7,80(d,J=8,0Hz), có 7 carbonmethine, 1 carbonmethylen, 10
5. 60 V.Đ. Lợi và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 56-61 carbon bậc bốn và 2 carbonmethyl. Tín hiệu Tài liệu tham khảo của nhóm carbonyl tại δC 163,2(C-8) bị dịch chuyển về phía trường mạnh do đó có thể dự [1] Đỗ Tất Lợi (2004), Cây thuốc và vị thuốc Việt đoán nhóm carbonyl này được nối với nitơ Nam, NXB Y học: 492-493 (-NCHO). Bên cạnh đó, trên các phổ này còn xác [2] Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, NXB. KH & KT, Hà Nội. nhận tín hiệu của 1 nhóm methoxy tại δC59,9 (11- OCH ) và 1 nhóm N-methyl tại δ 32,7. [3] Patani A, editor (2002), Indian Herbal 3 C Pharmacopoeia. Revised New ed. Mumbai: Thông qua các tương tác trực tiếp trên phổ Indian Drug Manufactures Association. HSQC độ chuyển dịch hóa học của các nguyên [4] Budavari S, editor (2001), The Merck Index. 13th tử proton được gán với các carbon tương ứng. ed. Whitehouse Station, NJ: Merck and Co Inc. So sánh các số liệu phổ NMR của L2 với hợp [5] Rastogi RP, Mehrotra BN, editors chất 10-O-demethyl-12-O-methylarnottianamide (1993), Compendium of Indian Medicinal [11] thấy độ chuyển dịch hóa học tại hầu hết các Plants. Vol. 3. PID, New Delhi: CSIR. vị trí phù hợp trừ độ chuyển dịch hóa học tại vị [6] Rastogi RP, Mehrotra BN, editors trí C-12 (147,5so với 153,6). Kết hợp với các (1995), Compendium of Indian Medicinal phân tích trên có thể khẳng định có sự demethyl Plants. Vol. 4. PID, New Delhi: CSIR. hóa tại vị trí C-12 của hợp chất 10-O-demethyl- [7] Rastogi RP, Mehrotra BN, editors 12-O- methylarnottianamide. Các tương tác (1998), Compendium of Indian Medicinal Plants. Vol. 5. PID, New Delhi: CSIR. HMBC chi tiết được liệt kê trong Bảng 2 và [8] G.V.Srinivasan, K.P. Unnikrishnan, A.B. Rema Hình 2. Từ những dữ liệu trên kết hợp so sánh Shree, and Indira Balachandranm (2008), “HPLC với các số liệu đã được công bố trong tài liệu Estimation of berberine in Tinospora tham khảo [10], hợp chất L2 được xác định là cordifolia and Tinospora sinensis”, Indian J iwamid. Pharm Sci 70(1): 96-99. [9] Martinb, M.T., Rasoanaivo, L. H., Raharisololalao, A. (2005), “Phenanthridine alkaloids from Zanthoxylummadagascariense”, Fitoterapia, 76, 4.Kết luận 590 [10] Ngoumfo,R.M.,Jouda,J.-B., Mouafo,F.T., Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp với Komguem,J., Mbazoa,C.D., Shiao, T.C., các phương pháp phân tích phổ hiện đại, chúng Choudhary,M.I., Laatsch,H., Legault,J., tôi đã phân lập xác định cấu trúc phân tử của 2 Pichette,A., Roy,R., (2010), “In vitrocytotoxic hợp chất benzophenanthridinelà decarin (1) activity of isolatedacridones alkaloids from vàiwamid (2). Đây là công bố đầu tiên về thành Zanthoxylum leprieurii Guill. et Perr.”, Bioorg. phần triterpen có trong cây dây đau xương Med. Chem.18, 3601-3605. trồng ở Việt Nam và hợp chất 2 lần đầu tiên [11] Hisashi Ishii, Tsutomu Ishikawa, Sheng-Teh Lu and Ih-Sheng Chen (1984), “Baeyer–Villiger- phân lập được từ cây dây đau xương chi type oxidation of an immonium group: the Tinospora. structural establishment of naturally occurring amides related to benzo[c] phenanthridine alkaloids”, J. Chem. Soc., 1, pp. 1769-1774.
6. V.Đ. Lợi và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 56-61 61 Two Alkaloid Compounds Isolated from Tinospora sinensis (Lour.) Merr) Growing in Vinh Phuc Province, Vietnam Vu Duc Loi1, Nguyen Thi Mai Trang1, TruongThi Van Hoai, Nguyen Thuc Thu Huong1, Nguyen Thanh Nam2 1VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam 2Department of Pharmacy, Military Hospital 7A, 466 Nguyen Trai, 5 District, Ho Chi Minh city, Vietnam Abstract: Tinospora sinensis (Lour.) Merr) grown in Vinh Phuc, Viet Nam is one of the most popular and valuable medicinal medicinal plants in the life. In the research and development program of medicinal materials, based on the use of chromatography methods, have isolated two compounds from bone pain harvests collected in Vinh Phuc. The chemical structure of the two compounds is determined to be decarine (1) and iwamide (2) based on mass spectral and nuclear magnetic resonance data comparing to the spectral data published in the literature refer. This is the first publication of the benzophenanthridine of Tinospora sinensis in Vietnam. Keywords: Tinospora sinensis, decarine, iwamide.