Đột biến mất đoạn ccr5-∆32 hiếm gặp ở người Việt Nam

Nội dung text: Đột biến mất đoạn ccr5-∆32 hiếm gặp ở người Việt Nam

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN CCR5-∆32 HIẾM GẶP Ở NGƢỜI VIỆT NAM Nghiêm Xuân Hoàn*; Lê Hữu Song* TÓM TẮT Đột biến mất đoạn 32 bp trên gen CCR5 (CCR5-∆32) có liên quan đến nhiều bệnh lý như nhiễm HIV, bệnh tự miễn Tuy nhiên, đột biến này chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm khảo sát đột biến CCR5-∆32 trên 100 bệnh nhân (BN) nhiễm virut viêm gan B (HBV), bao gồm 50 BN viêm gan B mạn tính, 25 BN xơ gan, 25 BN ung thư gan và 100 người khỏe mạnh làm nhóm chứng. Xác định đột biến CCR5-∆32 bằng kỹ thuật PCR. Kết quả cho thấy: không phát hiện đột biến này ở 100 người khỏe mạnh và 100 BN nhiễm HBV, đột biến CCR5-∆32 hiếm gặp ở người Việt Nam. * Từ khóa: CCR5; Đột biến CCR5-∆32. CCR5-∆32 deletion is rare in Vietnamese population summary The CCR5 deletion mutation (CCR5-∆32) is associated with many diseases such as HIV, autoimmune diseases However, it is still lack of data in Vietnamese population. This study was investigated the prevalence of the CCR5 deletion mutation (CCR5- ∆32) in 100 patients infected with hepatitis B virus (HBV) including 50 patients with chronic hepatitis B, 25 patients with live cirrhosis, 25 patients with heppatocellular carcinoma and 100 healthy control. The CCR5-∆32 was identified by using PCR assay. The CCR5- ∆32 was identified by using PCR assay. The result showed that there is not any case carried this mutation in our study and the CCR5-∆32 is rare in Vietnamese population. * Key words: CCR5; CCR5-∆32 deletion. ĐẶT VẤN ĐỀ thụ cảm thể của chúng hình thành một mạng lưới kiểm soát, hoạt hóa tế bào Chemokine (C-C motif) Receptor 5 (CCR5) lympho, đại thực bào và tế bào hình sao. Vì là thụ cảm thể hóa ứng động bạch cầu vậy, thụ cảm thể hóa ứng động đóng một thuộc họ các thụ cảm thể protein G xuyên vai trò trung tâm trong đáp ứng miễn dịch màng, tất cả các thụ cảm thể này đều có 7 chống lại nhiều tác nhân gây bệnh, đặc biệt domain xuyên màng (seven - transmembrane trong đáp ứng viêm. CCR5 là một đồng thụ G-protein coupled receptors - GPCRs) [1, cảm thể giúp HIV xâm nhập vào tế bào 2]. Gen mã hóa cho CCR5 nằm trên cánh TCD4 và đại thực bào, đây là cơ sở cho lây ngắn của nhiễm sắc thể số 3, nơi tập hợp nhiễm HIV [2]. các gen mã hóa cho nhiều thụ cảm thể hóa ứng động khác [2]. Chemokine và các dạng * Bệnh viện TWQĐ 108 Người phản hồi (Corresponding): Lê Hữu Song lehuusongdr108@yahoo.com.vn 45
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Cho đến nay, có khoảng 74 đột biến trên HIV, viêm gan B, C Tuy nhiên, cho đến gen này đã được mô tả và tìm hiểu, trong nay chưa có nhiều công trình nghiên cứu đó, đột biến CCR5-delta32 (CCR5-∆32) được về đột biến gen này. Do đó, chúng tôi tiến quan tâm nhiều nhất [3, 4]. Đột biến CCR5- hành nghiên cứu nhằm: Khảo sát tỷ lệ đột ∆32 xuất hiện nhiều hơn ở chủng tộc người biến gen CCR5-∆32 trên quần thể người da trắng với 10 - 20% người mang kiểu gen Việt Nam khỏe mạnh và BN nhiễm HBV. dị hợp tử (CCR5/CCR5-∆32) và 1% người mang kiểu gen đồng hợp tử (CCR5- ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP ∆32/CCR5-∆32), nhưng lại không được NGHIÊN CỨU phát hiện hoặc rất hiếm ở người châu Á, 1. Đối tƣợng nghiên cứu. châu Phi, Trung Đông và người Mỹ gốc Ấn 100 BN viêm gan B, trong đó, 50 BN [3, 4, 5]. Sự khác nhau về tần suất xuất viêm gan B mạn tính, 25 BN xơ gan, 25 BN hiện alen CCR5-∆32 giữa các chủng tộc ung thư gan và 100 người khỏe mạnh. được giải thích, đây là một đột biến thích nghi có lợi của loài người đối với các tác 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. nhân gây bệnh truyền nhiễm từ môi trường Tách chiết ADN từ máu ngoại vi có chống sống, nhưng lại là yếu tố bất lợi đối với sự đông EDTA bằng phenol chloroform, tủa phát triển một số bệnh truyền nhiễm, trong ADN bằng isopropanol. Thực hiện đột biến đó có HIV [3]. Theo Faure và Royer-Carenzi mất đoạn 32 nucleotide bằng kỹ thuật PCR (2008), phân bố của alen đột biến này phụ (Gero Hütter và CS) [7]. Các thành phần thuộc vào tính đa dạng di truyền vật chủ phản ứng như sau: GoTaq Green Master Mix và/hoặc nhiều yếu tố môi trường cũng như (Promega), bộ mồi đặc hiệu khuếch đại gen các nguồn bệnh trong tự nhiên, bởi vậy đã CCR5 với trình tự CCR5-32F: 5′-CTCCCA tạo ra bất lợi hoặc có lợi đối với vật chủ GGAATCATCTTTACC-3′, CCR5’-32R: 5′-TCA mang đột biến này [5]. TTTCGACACCGAAGCAG-3′. Chu trình nhiệt: 0 0 Đột biến này được đặc trưng bởi mất 94 C trong 4 phút, sau đó 35 chu kỳ (94 C/30 0 0 0 đoạn 32 bp trong vùng gen mã hóa cho giây; 53 C/30 giây; 72 C/40 giây) và 72 C vùng nội bào thứ 2 của thụ cảm thể CCR5 trong 7 phút. và tạo ra một bộ ba mã hóa kết thúc sớm Nguyên lý của phương pháp này được dẫn đến một protein không chức năng [4]. tóm tắt như sau: bộ mồi (mồi xuôi và mồi Người ta cho rằng đột biến CCR5-∆32 đóng ngược) đặc hiệu cho gen CCR5 được thiết vai trò ức chế HIV xâm nhập vào tế bào kế bao ngoài đoạn 32 bp dự kiến bị mất. lympho T do thay đổi đáp ứng miễn dịch và Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose số lượng phân tử trình diện kháng nguyên 3,5% để phân biệt kích thước các băng trên bề mặt tế bào liên quan đến nhiễm và ADN khuếch đại. Trong trường hợp gen tiến triển đến giai đoạn AIDS ở BN nhiễm CCR5 không bị mất đoạn (dạng hoang dại - HIV [6]. wild type), sản phẩm PCR sẽ có kích thước 200 bp, trong đó nếu bị mất đoạn 32 bp Việt Nam là một trong những nước trong (dạng đột biến - mutation type) có kích thước khu vực có khí hậu nhiệt đới gió mùa, tỷ lệ hình 1 bệnh truyền nhiễm và nhiệt đới cao như 168 bp ( ) [7]. 47
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Hình 1: Hình ảnh kết quả phân tích đột biến CCR5-∆32 (theo Gero Hütter và CS). (Ghi chú: Marker = thang chuẩn; CCR5 (+/+) = thể hoang dại; CCR5 (+)/CCR5-∆32 = thể đột biến mất đoạn 32 bp dạng dị hợp tử; CCR5-∆32 (+/+) = thể đột biến mất đoạn 32 bp dạng đồng hợp tử). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả tối ƣu hóa điều kiện PCR. Hình 2: Hình ảnh minh họa kết quả một số mẫu sau khi điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 3,5%. Hình ảnh điện di cho băng rõ nét, không có băng phụ, kích thước b»ng đúng như dự kiến, có 1 băng với kích thước 200 bp. (M = thang chuẩn; N = chứng âm). 2. Kết quả giải trình tự. Hình 3: Hình giải trình tự đoạn gen CCR5 bằng cặp mồi CCR5-32F, R của một mẫu bệnh phẩm. Không thấy đột biến mất đoạn 32 bp trên mẫu bệnh phẩm này. Tuy nhiên, tại vị trí nt 649 (NM_001100168.1) có một thay đổi bằng chèn thêm adenine. 48
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Hình 4: So sánh kết quả giải trình tự gen CCR5 với ngân hàng gen. Kết quả cho thấy đoạn gen thu được có độ tương đồng cao (98%) với ngân hàng gen. Hình 5: Hình ảnh một số thay đổi trên đoạn gen thu được so với ngân hàng gen. So với ngân hàng gen, mẫu bệnh phẩm thu được có 3 điểm khác biệt. 3. Kết quả phân tích trên các nhóm nghiên cứu. Tất cả 200 mẫu, bao gồm 100 mẫu BN nhiễm HBV và 100 người khỏe mạnh không thấy trường hợp nào mang gen CCR5 đột biến mất đoạn 32 bp. BÀN LUẬN GVHD) [8, 9]. Một kết quả nằm ngoài mong đợi trong điều trị căn bệnh thế kỷ HIV/AIDS Bên cạnh vai trò của đột biến CCR5-∆32 đã đưa các nhà khoa học quan tâm hơn đến trong sinh bệnh học bệnh nhiễm trùng, đột biến này. Đó là nghiên cứu của Hutter G người ta cũng đã chứng minh vai trò quan và CS cho thấy một trường hợp điều trị HIV trọng trong sinh bệnh học các bệnh tự miễn thành công đầu tiên bằng phương pháp ghép và gần đây được cho là yếu tố điều biến tế bào gốc từ một người cho có alen đột biến trong miễn dịch cấy ghép, trong bệnh mô dạng đồng hợp tử CCR5-∆32/CCR5-∆32 ghép chống chủ (graft-versus-host disease - [10]. Trường hợp đầu tiên chữa khỏi HIV 49
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 ở trên thực chất là thay thế hệ miễn dịch của đáng quan tâm, vì gần đây một số nghiên người bệnh bằng hệ miễn dịch của người cứu trên BN HIV/AIDS tại Việt Nam cũng đã cho có tế bào gốc mang gen đột biến dạng đề cập đến biến đổi này. Trong những nghiên đồng hợp tử CCR5-∆32/CCR5-∆32 có khả cứu đó, người ta thấy đột biến gen CCR5 tại năng miễn dịch tự nhiên với HIV, thông qua các vị trí S272P, G106R, C178R, W153C, ghép tủy của người cho để tạo ra tế bào R223Q và S336I [11]. máu mới có tính năng đặc biệt này. Từ những cơ sở khoa học thú vị mà thế KẾT LUẬN giới đã tìm thấy, chúng tôi hy vọng sẽ tìm Phương pháp phát hiện đột biến CCR5- được một vài đối tượng trong nhóm nghiên ∆32 bằng kỹ thuật PCR đã được xây dựng cứu có đột biến này. Tuy nhiên, với 200 đối thành công tại Khoa Sinh học phân tử, tượng, bao gồm cả BN nhiễm HBV và người Bệnh viện TWQĐ 108. Trong 200 đối tượng khỏe mạnh, không tìm thấy đột biến mất nghiên cứu, chúng tôi không phát hiện trường đoạn này. Kết quả này tương tự như những hợp nào mang đột biến CCR5-∆32 này. nghiên cứu khác về phân bố của elen CCR5- TÀI LIỆU THAM KHẢO ∆32 trên thế giới. Người ta cho rằng đột biến CCR5-∆32 xuất hiện ở phần lớn chủng tộc 1. Allen SJ, C.S, Handel TM. Chemokine: người da trắng với tỷ lệ 10 - 20% người receptor structure, interactions, and antagonism. mang kiểu gen dị hợp tử (CCR5/CCR5-∆32) Annu Rev Immunol. 2007, (25), pp.787-820. và chỉ 1% người mang kiểu gen đồng hợp 2. Alkhatib, G. The biology of CCR5 and CXCR4. Current Opinion in HIV and AIDS. tử (CCR5-∆32/CCR5-∆32). Trong khi đó, nó 2009, 4, pp.96-103. không được phát hiện hoặc rất hiếm ở 3. Alison P. Galvani, J.N. The evolutionary chủng người châu Á, châu Phi, Trung Đông history of the CCR5-D32 HIV-resistance mutation. và người Mỹ gốc Ấn [3, 4, 5]. Đây thực sự Microbes and Infection. 2005, 7, pp.302-309. là một điều đáng tiếc, vì ngày nay, y học 4. Gero Hütter. M.N, Daniel Nowak, Stefan phát triển, việc điều trị BN ung thư máu và Klein, Harald Klüter and Wolf-K Hofmann. The ngay cả BN HIV/AIDS bằng phương pháp effect of the CCR5-delta32 deletion on global ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài là điều gen expression considering immune response hoàn toàn có thể thực hiện được, nhưng vấn and inflammation. Journal of Inflammation. 2011, 8 (29), pp.1-8. đề là tìm được người cho tủy phù hợp hệ thống HLA đã khó thì việc tìm ra người cho 5. Eric Faure, M.R.-C. Is the European spatial distribution of the HIV-1-resistant CCR5-D32 allele có kiểu gen đồng hợp tử CCR5-∆32/CCR5- formed by a breakdown of the pathocenosis due ∆32 dường như còn khó khăn hơn nữa trên to the historical Roman expansion?. Infection, quần thể người Việt Nam. Genetics and Evolution. 2008, 8, pp.864-874. Nhưng dù sao, với một số ít số liệu giải 6. P. Schliekelman. C.G, M. Slatkin, Natural trình tự đoạn gen quan tâm chúng tôi cũng selection and resistance to HIV. Nature. 2001, 411, pp.545-546. thấy có một số thay đổi nucleotid đơn. Do 7. Hutter, G. et al. Long-term control of HIV số liệu còn hạn chế, chúng tôi không bàn by CCR5 Delta32/Delta32 stem-cell luận ở đây. Tuy nhiên, đó là một kết quả rất 50
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 transplantation. N Engl J Med. 2009, 360 (7), 10. Hutter G. N.D, Mossner M et al. Treatment pp.692-698. of HIV-1 infection by allogeneic CCR5-D32/D32 8. Fischereder M, L.B, Hocher B, Wuthrich RP, stem cell transplantation: a promising approach. Rothenpieler U, Schneeberger H, Panzer U, Stahl Retroviruses and Opportunistic Infections. 2008. RA, Hauser IA, Budde K et al. CC chemokine receptor 5 and renal-transplant survival. Lancet. 11. Luu, Q.P et al. HIV type 1 coreceptor 2001, 357, pp.1758-1761. tropism, CCR5 genotype and integrase Iihibitor 9. Bogunia-Kubik K, Suchnicki K, Lange A. resistance profiles in Vietnam: Implications for the CCR5 deletion mutation and its association with introduction of new antiretroviral regimens. AIDS the risk of developing acute graft-versus-host Res Hum Retroviruses. 28, (10), pp.1344-1348. disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Haematologica. 2006, 91, pp.1628-1634. Ngày nhận bài: 4/4/2013 Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/5/2013 Ngày bài báo được đăng: 23/5/2013 51
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 52