Độc tố seb (staphylococcal enterotoxin B) của vi khuẩn tụ cầu vàng

Nội dung text: Độc tố seb (staphylococcal enterotoxin B) của vi khuẩn tụ cầu vàng

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 ĐỘC TỐ SEB (Staphylococcal enterotoxin B) CỦA VI KHUẨN TỤ CẦU VÀNG Hoàng Cao Sạ*; Hoàng Đặng An Sinh**; Phạm Đức Minh*** TÓM TẮT Mục tiêu: chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố SEB của vi khuẩn tụ cầu. Đối tượng và phương pháp: nghiên cứu sử dụng các kháng thể đơn dòng kháng độc tố SEB của vi khuẩn Staphylococcus aureus. Que thử hoạt động dựa trên nguyên lý phản ứng mi n dịch kháng nguyên-kháng thể xảy ra trên màng mỏng. So sánh khả năng phát hiện của que thử với kỹ thuật ELISA trên mẫu nhi m SEB. Kết quả: que thử có khả năng phát hiện độc tố SEB ở nồng độ 50 ng/ml, có độ đặc hiệu 100%. Ở nồng độ 50 ng/ml và 25 ng/ml của độc tố SEB trên mẫu thử, que thử có độ nhạy lần lượt là 95% và 57% so với kỹ thuật ELISA. Kết luận: Học viện Quân y đã bước đầu chế tạo thành công que thử nhanh phát hiện độc tố SEB của vi khuẩn tụ cầu với quy mô trong phòng thí nghiệm. Que thử nhanh có giá thành thấp, d sử dụng, khả năng áp dụng cao trong thực ti n y học và cộng đồng. * Từ khóa: Vi khuẩn tụ cầu; Độc tố vi khuẩn tụ cầu; Que thử nhanh. Development of a Rapid Test to Detect SEB (Staphylococcal enterotoxin B) Summary Objectives: To produce lateral flow test for rapid detection of SEB (Staphylococcal enterotoxin B). Subjects and methods: This study uses monoclonal antibody against SEB. The lateral test operate based on antigen-antibody immune response on a thin membrane. The detection ability of the test strip was compared with ELISA on SEB-contaminated samples. Results: The lateral flow tests have the ability to detect SEB at concentrations of 50 ng/ml and a specificity of 100%. At the concentration of 50 ng/ml and 25 ng/ml of SEB toxin in the samples, the test strip has a respective sensitivity of 95% and 57%; compared to ELISA. Conclusion: Military Medical University has initial successfully made the lateral flow test to detect SEB toxin of Staphylococcus aureus. The strips are low-cost, easy to use and have high applicability in practice and community medicine. * Key words: Staphylococcus aureus; SEB; Lateral flow test. * Bệnh viện Đa khoa TP. Nam Định ** Học viện Quân y *** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Phạm Đức Minh (drminh103@yahoo.com) Ngày nhận bài: 24/01/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 02/03/2016 Ngày bài báo được đăng: 08/03/2016 44
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 ĐẶT VẤN ĐỀ các sợi Oligos [5]. Với ưu điểm giá thành thấp, d áp dụng, độ chính xác cao, que Trong các tác nhân gây ngộ độc thực thử nhanh đang là mục tiêu của nhiều phẩm do độc tố vi sinh vật, độc tố SEB phòng thí nghiệm cũng như các công ty (Staphylococcal enterotoxin B) của vi khuẩn sản xuất sản phẩm liên quan đến sinh tụ cầu vàng là nguyên nhân hay gặp, có thể học phân tử. Học viện Quân y hiện đang gây sốc độc tố dẫn đến tử vong [1, 7]. quản lý và khai thác một hệ thống dây Ngoài nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm, chuyền sản xuất que thử nhanh, bước vi khuẩn tụ cầu vàng còn có thể gây đầu chế tạo thành công một số loại que nhi m khuẩn huyết do chủng đa kháng thử ứng dụng trong chẩn đoán [2, 4, 5]. thuốc rất nguy hiểm, tỷ lệ tử vong cao [8]. Hệ thống phun que thử (Arista, Hoa Kỳ), Trong hoạt động quân sự, độc tố vi khuẩn có khả năng hoạt động bán tự động hoặc tụ cầu còn có nguy cơ sử dụng trực tiếp tự động hoàn toàn với công suất từ 1.000 - như một vũ khí sinh học nguy hiểm. 10.000 que thử/24 giờ. Tại Hoa Kỳ, S. aureus là 1 trong 5 tác Hiện tại có một số phương pháp nhân gây bệnh hàng đầu liên quan đến thường dùng để phát hiện vi khuẩn tụ bệnh truyền qua thực phẩm. Trung tâm cầu vàng và độc tố SEB trong thực phẩm Kiểm soát và Ngăn ngừa Bệnh (CDC) ước bao gồm: nuôi cấy; phương pháp ELISA; tính hàng năm có khoảng 240.000 bệnh phương pháp khuếch đại gen (PCR), que nhân với 1.000 ca nhập viện và 6 trường thử nhanh [8]. Trong đó que thử nhanh có hợp tử vong liên quan đến ngộ độc thức ưu thế trong sàng lọc và được ưu tiên ăn do tụ cầu vàng [7]. sử dụng. Xuất phát từ những yêu cầu đó, Tại Việt Nam, tình hình vệ sinh an toàn đề tài nhằm: Chế tạo thành công que thử thực phẩm đang ở mức báo động, ngộ nhanh phát hiện độc tố SEB của vi khuẩn độc thực phẩm trong cộng đồng do độc tố tụ cầu với quy mô trong phòng thí nghiệm. của tụ cầu vàng thường xuyên xảy ra [1]. Chính vì vậy, phát hiện độc tố vi khuẩn tụ ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP cầu vàng trong thực phẩm và một số NGHIÊN CỨU bệnh phẩm khác giúp cho quá trình chẩn . Đối tƣợng nghiên cứu. đoán, điều trị và dự phòng đạt kết quả - Độc tố chuẩn: độc tố SEB (Staphylococcal cao [1, 4]. enterotoxin B) của vi khuẩn tụ cầu, code Hiện nay, que thử nhanh đã và đang S4881 (Sigma). chiếm ưu thế trong ứng dụng y học và - Độc tố đối chứng: (1) độc tố SEA các lĩnh vực liên quan. Nguyên lý của que (Staphylococcal enterotoxin A) của vi thử nhanh được Singer và Plotz (1956) khuẩn tụ cầu, code S9399 (Sigma); (2) [6] khởi đầu nghiên cứu và phát triển, độc tố không chịu nhiệt LT (heat labile cho đến nay nghiên cứu có nhiều cải tiến. toxin) của vi khuẩn E. coli, code E8656 Đối tượng phát hiện và nguyên liệu chế (Sigma); (3) độc tố CTX (Cholerae toxin) tạo que thử nhanh không chỉ dừng lại ở của vi khuẩn tả, code G-117 (Enza Life kháng nguyên, kháng thể mà có thể là Sciences). 45
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 2. Vật liệu nghiên cứu. 3. Phƣơ g pháp ghi cứu. * Dụng cụ, thiết bị: dụng cụ và thiết bị * Phương pháp chế tạo que thử nhanh: chuyên dụng của Phòng Vi sinh vật và - Thiết kế: Mầm bệnh sinh học, hệ thống sản xuất Thiết kế chế tạo que thử nhanh dựa que thử nhanh (Hãng Arista, Hoa Kỳ) tại theo quy trình của Công ty Arista (Hoa Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân Kỳ). Đầu tiên các loại màng sẽ được xử lý sự, Học viện Quân y. bằng dung môi thích hợp, để khô, tiếp theo * Kháng thể: phun lên màng kháng thể, cuối cùng lắp Có 3 kháng thể được gắn lên màng: ghép các bộ phận và giữ chặt trên một đế kháng thể phát hiện (KT1), kháng thể bắt nhựa. Quá trình tiến hành ở điều kiện giữ (KT2) và kháng thể kiểm tra (KT3). nhiệt độ khoảng 25oC, độ ẩm tương đối Kháng thể phát hiện (Detection Antibody) dưới 40%. Sau khi hoàn thành, cất giữ là C86400M sẽ được gắn với hạt vàng, sản phẩm trong gói hàn nhiệt kín, có vật sau đó gắn lên màng chứa cộng hợp liệu chống ẩm bảo quản. (Conjugate pad). Kháng thể bắt giữ (Capture antibody) là C86220M, sẽ gắn lên màng NC ở vị trí test line. Kháng thể kiểm tra là ABCAM-0500, sẽ gắn lên màng NC ở vị trí vạch đối chứng (control line). * Màng gắn trên que thử: Mỗi thanh test được cấu tạo bởi 5 bộ phận chính sau: màng hút mẫu (Sample pad); màng chứa chất cộng hợp màu 1. Màng hút mẫu (Conjugate pad); màng NC (Nitrocellulose 2. Màng chứa chất cộng hợp màu (chứa KT1) 3. Màng phát hiện đầu tiên membrance); màng hút trên (Absorbent 4. Màng nitrocellulose pad) và đế nhựa giữ (Plastic adhesive 5 (a). Vạch phát hiện mẫu (chứa KT2) backing card) của que thử. Được đặt mua 5 (b). Vạch đối chứng (chứa KT3) của Công ty Ahlstrom, P.O. Box 329, 6. Màng hút trên Salmisaarenaukio 1, FI-00180 Helsinki, 7. Đế nhựa giữ Phần Lan và Công ty Advanced Microdevices Hình 1: Sơ đồ cấu tạo của test (mdi), 20-21 Industrial Area, Ambala Cantt phát hiện nhanh. 133 006, Ấn Độ. - Nguyên lý hoạt động của que thử: * Dung môi xử lý màng: Kháng thể phát hiện (KT1) sẽ gắn với Các màng đều có chức năng riêng biệt kháng nguyên đặc hiệu và gặp kháng thể và tối ưu hóa hoạt động của que thử, đều bắt giữ (KT2). Nếu phản ứng mi n dịch phải xử lý trước khi gắn lên test. Mỗi đặc hiệu xảy ra sẽ cho kết quả vạch dung môi sẽ đặc hiệu cho một loại màng dương tính. Tất cả các phức hợp đi tiếp nhất định và làm tăng hoạt tính của màng gặp kháng thể kiểm tra (KT3) sẽ làm xuất sau xử lý. hiện màu tại vạch đối chứng. 46
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 - Tối ưu hóa: hiệu với độc tố SEA của vi khuẩn tụ cầu, Công đoạn tối ưu hóa sẽ cho công độc tố không chịu nhiệt LT của vi khuẩn thức phối hợp tối ưu giữa nồng độ kháng E. coli và độc tố CTX của vi khuẩn tả. thể cũng như các hóa chất khác trên que 4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. nhúng sao cho đảm bảo nguyên tắc “sử * Địa điểm nghiên cứu: Labo Vi sinh và dụng hàm lượng tối thiểu các chất để tạo các mầm bệnh sinh học, Trung tâm nghiên được thiết bị có tính năng tối ưu”. cứu Y Dược học Quân sự, Học viện * Phương pháp thử nghiệm que nhúng Quân y và Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện với mẫu thử: Quân y 103. Đối chiếu que nhúng với kỹ thuật ELISA * Thời gian nghiên cứu: từ 10 - 2014 đến trong thử nghiệm với mẫu độc tố để xác 10 - 2015. định độ nhạy và độ đặc hiệu. Đánh giá độ nhạy của que thử qua khả năng phát hiện 5. Xử lý số liệu. mẫu SEB ở các nồng độ pha loãng khác Quản lý và phân tích số liệu bằng phần nhau (5 - 200 ng/ml). Kiểm chứng độ đặc mềm Epi.info 7. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Chế tạo và tối ƣu hóa que hú g. * Nồng độ kháng thể trên màng que thử: Hình 1: Que thử có hàm lượng KT1: 0,25 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card. Hình 2: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card. 47
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Hình 3: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 1 µg/card; KT3: 0,25 µg/card. Vị trí KT3: vạch chứng; vị trí KT2: vạch test. Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card cho tín hiệu có thể nhận biết được. * Khả năng phát hiện của que thử trên mẫu độc tố chuẩn: Hình 4: Thử que nhúng với độc tố SEB ở nồng độ 25 ng/ml. Hình 5: Thử que nhúng với độc tố SEB ở nồng độ 50 ng/ml. Vị trí KT3: vạch chứng; vị trí KT2: vạch test. Que thử cho kết quả dương tính (2 vạch) rõ nét khi mẫu SEB ở nồng độ 50 ng/ml sau thời gian 15 phút. 2. Tí h đặc hiệu của que thử. 48
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Hình 6: Thử que nhúng với các độc tố SEA, CTX, LT nồng độ 100 ng/ml. Vị trí KT3: vạch chứng; vị trí KT2: vạch test. Que thử cho kết quả âm tính (tín hiệu tại vạch chứng KT3) với độc tố SEA của vi khuẩn Staphylococcus aureus, độc tố CTX của vi khuẩn tả và độc tố LT của vi khuẩn Escherichia coli đều cho kết quả âm tính. 3. So sánh que thử với kỹ thuật ELISA trong phát hiệ độc tố SEB. Bảng 1: Kết quả thử nghiệm que thử nhanh và ELISA trên mẫu thực phẩm nhi m SEB nồng độ 50 ng/ml. ELISA Tổng Kết quả (+) (-) (+) 114 0 114 Que thử nhanh (-) 6 0 6 Tổng 120 0 120 Se [95%CI] = 0,95 [0,89 - 0,98] Bảng 2: Kết quả thử nghiệm que thử nhanh và ELISA trên mẫu thực phẩm nhi m SEB nồng độ 25 ng/ml. ELISA Tổng Kết quả (+) (-) (+) 68 0 68 Que thử nhanh (-) 51 1 52 Tổng 119 1 40 Se [95%CI] = 0,57 [0,48 - 0,66] Ở nồng độ 50 ng/ml và 25 ng/ml của độc tố SEB trên mẫu thử, que thử có độ nhạy lần lượt 95% và 57% so với kỹ thuật ELISA về khả năng phát hiện độc tố SEB. 49
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 BÀN LUẬN nhau. Kết quả cho thấy tín hiệu của que 1. Quy trình chế tạo que thử nhanh. thử có thể phát hiện được bằng mắt Nghiên cứu sử dụng kết quả từ một thường khi nồng độ độc tố trong mẫu thử khảo sát trước đó của tác giả trên 04 là 50 ng/ml trong 5 - 10 phút. kháng thể đơn dòng phát hiện độc tố SEB Do thời gian phát hiện nhanh, nên trên cho thấy các kháng thể có khả năng phát thực tế que thử nhanh sẽ giúp ích trong hiện kháng nguyên khác nhau, xếp theo sàng lọc nhanh các mẫu thực phẩm nhi m thứ tự tăng dần của độ nhạy lần lượt là: độc tố trước khi tiến hành xét nghiệm sâu C01544M, C01543M, C86220M, C86400M. hơn, điều này làm giảm chi phí trong xét Dựa trên những kết quả đó, quá trình nghiệm chẩn đoán. Khi áp dụng phương sàng lọc và lựa chọn sẽ cho cặp kháng pháp này cùng với những phương pháp thể tối ưu để sử dụng trên que thử. Kết khác, đặc biệt phương pháp khuếch đại quả khảo nghiệm cho thấy khi nồng độ kháng thể 0,5 µg/card tại màng cộng hợp gen định lượng và mi n dịch định lượng, và màng NC của cặp kháng thể C86220M, các nhà khoa học có thể trả lời nhanh và C86400M sẽ cho tín hiệu rõ. chính xác về chủng loại vi khuẩn, số lượng Sản xuất que thử cần quan tâm đến mầm bệnh bị nhi m trong thực phẩm và giá thành sản phẩm, do vậy cần sử dụng nồng độ độc tố có trong mẫu [4]. lượng nguyên liệu tối thiểu để có sản Để đánh giá tính đặc hiệu của que thử, phẩm đạt yêu cầu. Chính vì những lý do một số đối tượng được chọn là độc tố này nên công thức phối hợp tối ưu về SEA của vi khuẩn tụ cầu vàng và độc tố hàm lượng kháng thể tại màng cộng hợp của hai vi khuẩn đường ruột phổ biến và (KT1-kháng thể phát hiện), vạch kiểm tra có tính độc cao, đó là độc tố không chịu (KT2-kháng thể bắt giữ), vạch đối chứng nhiệt LT (heat labile toxin) của vi khuẩn (KT3) lần lượt: 0,5; 0,5; 0,25 µg/card. Với E. coli và độc tố CTX (Cholerae toxin) của các nguyên liệu và hóa chất phục vụ chế tạo que thử hiện tại, giá thành 01 que thử vi khuẩn tả. Kết quả cho thấy que thử khoảng 10.000 VND. Trong tương lai, có không có phản ứng chéo với 2 loại độc tố thể nghiên cứu dùng kháng thể polyclonal SEA, LT và CTX. thay thế cho monoclonal nhằm tăng ngưỡng Dựa trên sự tương đồng về nguyên lý phát hiện và giảm chi phí tạo kít. mi n dịch [3, 6], nghiên cứu đã lựa chọn 2. Khả ă g phát hiện của que thử kỹ thuật ELISA để so sánh khả năng phát nhanh với độc tố SEB của vi khuẩn tụ hiện độc tố SEB trên mẫu nghiên cứu ở cầu vàng. những nồng độ khác nhau. Kết quả cho Que thử nhanh sau khi tối ưu được thấy que thử có độ tương đồng cao thử với độc tố SEB ở các nồng độ khác (95%) với ELISA ở nồng độ 50 ng/ml và 50
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 thấp hơn (57%) ở nồng độ 25 ng/ml. Điều toàn có thể đáp ứng được yêu cầu thực này có thể do ngưỡng phát hiện của tế khi điều tra vụ dịch. ELISA (10 ng/ml) thấp hơn nhiều so với Nhờ đặc tính này, que thử tạo ra do có que thử nhanh (50 ng/ml) [3] nên khả thể phát hiện nhanh và chính xác độc tố năng phát hiện của ELISA nhạy hơn so SEB nên có thể khẳng định nguyên nhân với que thử nhanh, đặc biệt ở những mẫu gây ngộ độc trực tiếp. Chứng tỏ que thử có nồng độ thấp. Trên thực tế, để chẩn có ý nghĩa thực ti n cao khi so với các đoán chính xác, cần phối hợp một số kỹ kỹ thuật chỉ phát hiện được vi khuẩn thuật, trong đó que thử nhanh chỉ là S. aureus đơn thuần. nghiệm pháp sàng lọc [4, 5]. KẾT LUẬN 3. Giá trị ứng dụng thực tiễn của que thử nhanh phát hiệ độc tố SEB Đã chế tạo được que thử nhanh phát của vi khuẩn tụ cầu. hiện độc tố vi khuẩn tụ cầu vàng ở quy mô phòng thí nghiệm. Que thử sử dụng Tại Việt Nam, tình huống hay gặp ngộ kháng thể phát hiện (Detection Antibody) độc thực phẩm do tụ cầu khuẩn vàng là C86400M với khối lượng 0,5 µg/card, (Staphylococcus aureus) là ở tiệc cưới, kháng thể bắt giữ (Capture antibody) là liên hoan. Do phải chuẩn bị cho nhiều C86220M với khối lượng 0,5 µg/card và suất ăn nên thức ăn cần nấu trước và để kháng thể kiểm tra (Control antibody) là qua đêm (> 6 giờ). Tụ cầu khuẩn nhi m từ môi trường hoặc từ người chế biến sẽ ABCAM-0500 với khối lượng 0,25 µg/card. phát triển rất nhanh trong thức ăn có hàm Que thử có khả năng phát hiện được độc lượng dinh dưỡng thích hợp (trứng, thịt, tố SEB ở nồng độ 50 ng/ml, có độ đặc hải sản) và sinh ra độc tố đường ruột. hiệu tuyệt đối và độ nhạy 95% so với kỹ Độc tố này rất bền với nhiệt, do đó trước thuật ELISA tại nồng độ này. khi ăn, mặc dù có đun lại cũng không huỷ TÀI LIỆU THAM KHẢO được độc tố. Khi ăn phải thức ăn có nhi m độc tố SEB, chỉ sau 30 phút đến 1 1. Nguyễn Hùng Long, Phạm Đức Minh. giờ sẽ xuất hiện các triệu chứng nôn Thực trạng ngộ độc thực phẩm giai đoạn mửa, tiêu chảy [1]. 2006 - 2010. Tạp chí Y - Dược học Quân sự. 2015, Vol 40, No 2, tr.02-09. Do ngưỡng gây bệnh của độc tố SEB 2. Phạm Đức Minh, Lê Quốc Tuấn, rất thấp, chỉ cần 100 ng độc tố đã có thể Nguyễn Hùng Long, Hoàng Văn Lương. gây ra triệu chứng ngộ độc nên kỹ thuật Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát hiện phát hiện cần có độ nhạy cao [8]. Que trực khuẩn Listeria monocytogenes. Tạp chí thử nhanh trong nghiên cứu này có Y - Dược học Quân sự. 2012, Vol 37, No 2, ngưỡng phát hiện 50 ng/ml nên hoàn tr.72-77. 51
9. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 3. Phạm Đức Minh, Nguyễn Hùng Long, 6. Singer JM and Plotz CM. The latex Hoàng Văn Lương. Nghiên cứu ứng dụng fixation test. Application to the serologic kỹ thuật ELISA phát hiện độc tố vi khuẩn tả. diagnosis of rheumatoid arthritis. American Tạp chí Y học Việt Nam. 2014, tập 419, 6 (1), Journal of Medicine. 1956, 21, pp.888-892. tr.46-49. 7. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson MA, Roy SL, Jones 4. Phạm Đức Minh, Hoàng Văn Lương. JL, Griffin PM. Foodborne illness acquired in Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát hiện the United States-major pathogens. Emerg độc tố vi khuẩn tả. Tạp chí Y - Dược học Infect Dis. 2011, 17 (1), pp.7-15. Quân sự. 2015, Vol 40, No 2, tr.18-24. 8. Tallent SM, Degrasse JA, Wang N, 5. Hong Nhung Tran et al. Optical nanoparticles: Mattis DM, Kranz DM. Novel platform for the synthesis and biomedical application. Adv. detection of Staphylococcus aureus enterotoxin Nat. Sci.: Nanosci. Nanotechnol. 6 (2015) 023002 B in foods. Appl Environ Microbiol. 2013, 79 (5), (14pp). doi:10.1088/2043-6262/6/2/023002. pp.1422-1427. 52