Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật nested rt-pcr trong xác định Arn Rubella

Nội dung text: Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật nested rt-pcr trong xác định Arn Rubella

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA KỸ THUẬT NESTED RT-PCR TRONG XÁC ĐỊNH ARN RUBELLA Nguyễn Duy Bắc*; Dương Thuận Thiên *; Lê Thị Dung* Nguyễn Viết Trung*; Đặng Tiến Trường*; Trịnh Hải Tuấn TÓM TẮT Sốt phát ban Rubella hay “Sởi Đức” do virut Rubella gây nên, bệnh thường nhẹ, ít biến chứng nhưng lại gây nhiều biến chứng đối với thai nhi, đặc biệt trong 3 tháng đầu của thai kỳ. Chẩn đoán nhiễm Rubella sớm giúp kiểm soát tốt dịch, hạn chế biến chứng, đặc biệt đối với phụ nữ có thai. Nghiên cứu này nhằm đánh giá độ chính xác của kỹ thuật nested RT-PCR đã được công bố trước đây trong xác định ARN của virut. Kết quả cho thấy, kỹ thuật nested RT-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu 100%, ngưỡng phát hiện thấp 10-6ng/ul. Kỹ thuật nested RT-PCR giúp chẩn đoán nhanh, chính xác Rubella và kiểm soát dịch hiệu quả. Sử dụng kỹ thuật này cho chẩn đoán trước sinh Rubella sẽ giúp hạn chế số ca nhiễm Rubella bẩm sinh. * Từ khóa: Virut Rubella; Nested RT-PCR; ARN; Độ nhạy; Độ đặc hiệu. SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF NESTED RT-PCR IN DETECTION OF RUBELLA RNA Summary Typhus rubella or "German measles" caused by Rubella virus is a mild disease with fewer complications but does more harm to fetus in pregnant women, especially in the first 3 months of pregnancy. Early diagnosis can control Rubella epidemic, limitation of losses, especially for pregnant women. This study aimed to evaluate the accuracy of previously published nested RT-PCR technique in determining RNA viruses. Results showed that nested RT-PCR technique had high sensitivity and specificity (100%), a low detection threshold 10-6ng/ul. Thus, nested RT-PCR help diagnose Rubella rapidly and accurately and control the epidemic effectively. Using this technique for prenatal diagnosis of Rubella will limit cases of congenital Rubella infection. * Key words: Rubella virus; Nested RT-PCR, RNA; Sensitivity; Specificity. ĐẶT VẤN ĐỀ thai chết lưu, dị tật thai nhi Thai phụ mang thai nhiễm Rubella, thai nhi có nguy Sốt phát ban Rubella hay “Sởi Đức” do cơ bị nhiễm Rubella bẩm sinh (Congenital virút Rubella gây nên, hay gặp chủ yếu ở Rubella Infection - CRI) và bị hội chứng trẻ em, thiếu niên và những người trẻ tuổi Rubella bẩm sinh (Congenital Rubella [4]. Bệnh thường nhẹ, ít biến chứng. Tuy Syndrome - CRS) [11]. nhiên, phụ nữ mang thai nhiễm Rubella có thể gây nhiều biến chứng như: sẩy thai, * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Duy Bắc (bac-hvqy@yahoo.com) Ngày nhận bài: 15/12/2013: Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/01/2014 Ngày bài báo được đăng: 11/02/2014 16
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 Chẩn đoán Rubella bằng lâm sàng khó Thời điểm đó, số lượng mẫu chứng và chính xác vì Rubella chỉ là một trong số mẫu bệnh chưa đủ lớn nên chưa đánh rất nhiều nguyên nhân gây sốt có phát giá được độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ ban khác như virút sởi, dengue, parvovirus thuật. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu trên B19, Chikungunya [5]. Chẩn đoán nhiễm thế giới đã đánh giá kỹ thuật nested RT- Rubella cấp tính chủ yếu dựa vào phương PCR có độ chính xác cao và được Tổ pháp phát hiện hiệu giá kháng thể IgM, chức Y tế Thế giới khuyến cáo sử dụng chuyển đảo huyết thanh từ IgG (-) sang trong chẩn đoán nhiễm Rubella trước và IgG (+). Gần đây, một số kỹ thuật đã được sau sinh [5, 9, 10]. ứng dụng để chẩn đoán virut Rubella Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Chúng tôi hành đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu xây dựng kỹ thuật nested RT-PCR và áp của kỹ thuật nested RT-PCR trong xác dụng trong nghiên cứu tại Trung tâm định ARN của virut Rubella đã được công Nghiên cứu Y Dược học Quân sự [1]. bố trước đây. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu. 60 mẫu bệnh phẩm virut Rubella được chẩn đoán xác định bằng phương pháp phân lập virut và 60 mẫu bệnh phẩm nhiễm các loại vi khuẩn và virut khác gây triệu chứng phát ban như Rubella gồm: 12 mẫu sởi (ARN), 20 mẫu dengue (ARN), 3 mẫu parvovirus B19 (ADN), 8 mẫu Chikungunya (ARN) 16 mẫu Coxsackie A (ARN), 01 mẫu adeno virut (ADN) do Viện Vệ sinh Dịch tễ TW và Pasteur Nha Trang cung cấp. 2. Primer cho phản ứng nested RT-PCR. Bảng 1: Trình tự các primer phục vụ nhân ADN của virut Rubella. Ru1-F CAACACGCCGCACGGACAAC 8807 ± 8826 66 185bp Ru1-R CCACAAGCCGCGAGCAGTCA 8991 ± 8972 66 Ru2-F CTCGAGGTCCAGGTCCYGCC 8826 ± 8845 68 143bp Ru2-R GAATGGCGTTGGCAAACCGG 8968 ± 8949 64 3. Tách chiết ARN. Tách ARN của virut từ 140 μl dịch chứa tế bào nhiễm virut sau nuôi cấy bằng bộ kit Qiagen ARN mini, theo quy trình chuẩn của nhà sản xuất (Qiagen, Đức), ARN tách 0 chiết được lưu trữ ở -80 C cho tới khi sử dụng. 4. Phản ứng khuếch đại gen nested RT-PCR. - Phản ứng RT-PCR: Bảng 2: Thành phần phản ứng RT-PCR [1]. 9
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 kéo dài 72°C trong 1 phút. Cuối cùng là µl giai đoạn kéo dài 72°C trong 10 phút. 1. QIAGEN OneStep RT-PCR 2 Thực hiện phản ứng PCR trên máy PCR enzyme Mix 2. QIAGEN OneStep RT-PCR 10 Ependoft AG. buffer 5X Sau khi nhân ADN đích, điện di sản 3. Q - Solution 10 phẩm ADN trên agarose gel 2% và phân 4. dNTP mix 10 mM 2 tích kết quả. Sản phẩm ADN của phản ứng nested RT-PCR theo lý thuyết là 143 bp. 5. R1-F 1 Thiết bị nghiên cứu tại Trung tâm Nghiên 6. R1-R 1 cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân 7. ARN mẫu 2 y. Hóa chất nghiên cứu gồm Qiagen ARN 8. Nước sạch 22 mini kít, Kit Qiagen onestep, primer do Hãng Tổng 50 µl Invitrogen tổng hợp, nước khử ion, agarose, Chu trình nhiệt gồm các giai đoạn sau: thang ADN chuẩn do Hãng Sigma cung cấp. chuyển đổi ARN thành cADN ở 50°C Phân tích kết quả chẩn đoán dựa vào trong 30 phút, sau đó biến tính 95°C ở 15 bảng 2x2 để xác định độ nhạy và độ đặc phút; thực hiện 30 chu kỳ gồm các giai hiệu của kỹ thuật. đoạn: biến tính ở 94°C trong 30 giây, bám KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU mồi 60°C trong 30 giây, kéo dài 72°C 1. Kết quả xác định ARN Rubella bằng trong 1 phút. Cuối cùng là giai đoạn kéo phản ứng nested RT-PCR. dài 72°C trong 10 phút. - Phản ứng nested PCR: Bảng 3: Thành phần phản ứng nested 200 bp PCR [1]. 100 bp µl 143 bp 1 10X Buffer (15 mM Mg2+) 5 7 6 5 4 3 2 1 M 2 Kapa Taq ADN polymerase 0,2 (5U/µl) NC2 NC1 3 dNTP mix 25 mM 0,8 4 R2-F 1 5 R2-R 1 6 Sản phẩm RT-PCR (µl) 4 M: marker 100; NC1: chứng âm của NC 7 H2O 38 của phản ứng RT-PCR; NC2 chứng âm hóa Tổng 50 chất vòng 2; 1 - 7 lần lượt là các băng Chu trình nhiệt gồm các giai đoạn sau: sản phẩm của phản ứng ở Ta lần lượt là biến tính 95°C ở 15 phút; thực hiện 30 chu 570C, 580C, 590C, 600C, 610C, 630C, 640C. kỳ gồm các giai đoạn: duỗi xoắn ở 94°C trong 30 giây, bám mồi 61°C trong 30 giây, 20
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 Kết quả tối ưu hóa trên máy Eppendorf AG được thể hiện ở hình 1. Từ kết quả này chúng tôi lựa chọn được nhiệt độ gắn primer của phản ứng nested PCR là 61oC. 2. Đánh giá độ chính xác của kỹ thuật nested RT-PCR trong chẩn đoán nhiễm virut Rubella. * Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật: Bảng 4: Kết quả chẩn đoán trên 120 mẫu bằng kỹ thuật nested RT-PCR. + - Rubella 60 0 60 Virut khác 0 60 60 Cộng 60 60 120 Chúng tôi tính được độ nhạy (Se) và độ đặc hiệu (Sp) của kỹ thuật: - Độ nhạy của kỹ thuật nested RT-PCR: Se = [60:(60 + 0)] x 100% = 100%. - Độ đặc hiệu của kỹ thuật nested RT-PCR: Sp = [60:(60 + 0)] x 100% = 100%. Kết quả tính toán cho thấy, độ nhạy 100% và độ đặc hiệu của kỹ thuật 100%. Bên cạnh đó, các cặp primer của phản ứng nested RT-PCR không có phản ứng chéo với hệ gen của các loại virut khác gây triệu chứng phát ban như Rubella. N2 M 1 - 12 N1 P C M 13 - 27 Hình 2: Kết quả chẩn đoán mẫu ARN của Rubella bằng nested RT-PCR. M: marker 100; NC1: chứng âm của phản ứng RT-PCR; NC2 chứng âm hóa chất vòng 2; 1 - 27 là các băng sản phẩm từ các mẫu ARN Rubella. 21
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 1 - 12 N2 N1 P M C M 13 - 27 Hình 3: Kết quả chẩn đoán mẫu nhiễm virut không phải Rubella. M: marker 100; NC1: chứng âm của phản ứng RT-PCR; NC2 chứng âm hóa chất vòng 2; 1 - 27 là các băng sản phẩm từ các mẫu nhiễm virut không phải Rubella. * Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested RT-PCR: Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật bằng ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested RT-PCR đối với ARN virut Rubella. Để xác định ngưỡng này, chúng tôi sử dụng quy trình nested RT-PCR đã tối ưu hóa chẩn đoán trên mẫu ARN Rubella. Pha loãng các mẫu này theo hệ số 10. Sử dụng 01 mẫu chứng dương, tách chiết ARN, đo trên máy Nano drop. Tiến hành pha loãng thành dung dịch ARN có nồng độ 100 ng/µl. Tiếp tục pha loãng dần mẫu ARN của virut Rubella có nồng độ 100 ng/µl (tương đương 105 pg/µl) theo cấp số nhân với hệ số 10-1 thành các dung dịch ARN có nồng độ 100 ng/µl, 10 ng/µl, 1 ng/µl, 10-1 ng/µl, 10-2 ng/µl, 10- 3 ng/µl, 10-4 ng/µl, 10-6 ng/µl, 10-7 ng/µl, 10-8 ng/µl. 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M NC Hình 4: Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested RT-PCR. M: marker 100; NC: chứng âm của NC của phản ứng RT-PCR; 1-11 lần lượt là các băng sản phẩm của mẫu 100 ng/µl, 10 ng/µl, 1 ng/µl, 10-1 ng/µl, 10-2 ng/µl, 10-3 ng/µl, 10-4 ng/µl, 10-6 ng/µl, 10-7 ng/µl, 10-8 ng/µl. Kết quả hình 4 cho thấy, thực hiện kỹ thuật nested RT-PCR có thể phát hiện BÀN LUẬN mẫu có chứa nồng độ ở mức 10-6 ng/µl, Trong nghiên cứu này, chu trình nhiệt tương ứng 0,1 pg/µl. Điều này cho thấy của phản ứng RT-PCR và nested PCR đã ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested RT- được hiệu chỉnh lại trên máy Eppendorf PCR rất thấp. AG nên có sự khác biệt so với chu trình 22
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 nhiệt được tối ưu hóa trên máy ABI 9700 ARN của Rubella trong nhiều loại mẫu đã công bố trước đây. bệnh phẩm khác nhau. Kết quả xét nghiệm 1. Độ nhạy của kỹ thuật. nhận được trong vòng 24 giờ kể từ khi Kết quả nghiên cứu này cho thấy, kỹ nhận mẫu, ngược lại, phương pháp phân thuật nested RT-PCR có độ nhạy 100%. lập virut phải mất 3 - 4 tuần. Như vậy, RT- Độ nhạy của kỹ thuật còn được thể hiện ở PCR ưu việt hơn hẳn so với phương ngưỡng phát hiện ARN của virut rất thấp pháp phân lập virut về thời gian, ít phức (10-6 ng/µl). Theo Thanapal AR và CS tạp hơn, đòi hỏi thiết bị đơn giản hơn (2008), phương pháp RT-PCR được cho [6, 7]. Ưu điểm này giúp kỹ thuật có thể có độ nhạy và ổn định hơn so với áp dụng trên phạm vi rộng, nhiều địa phương pháp real time PCR [10]. Cũng phương hơn. Hơn nữa, phân lập virut theo Bosma và CS (1995), RT-PCR có độ cũng gặp khó khăn nh• nồng độ virut thấp nhạy tương đương với 2 copies [6]. Trong dễ dẫn tới âm tính giả. Phương pháp khi đó, nghiên cứu của Kiyoko Okamoto huyết thanh học phát hiện IgM và IgG và CS (2011) khẳng định phương pháp kháng virut Rubella phát hiện nhanh, dễ real time PCR khi sử dụng kit Taqman và sử dụng, không đòi hỏi kỹ thuật viên có chạy trên máy của hãng ABI chỉ cho chẩn trình độ cao và có thể làm ngoài labo. đoán dương tính khi có tối thiểu 10 copies Nhưng kỹ thuật huyết thanh học cần được ARN của Rubella trong mẫu [8]. Điều này chỉ định đúng thời gian, tránh hiện tượng cho thấy kỹ thuật RT-PCR ưu thế hơn so âm tính giả do chỉ định quá sớm hoặc quá với kỹ thuật real time PCR về độ nhạy. muộn (chẩn đoán bằng IgM), dẫn tới bỏ 2. Độ đặc hiệu. sót người mắc bệnh. Bên cạnh đó, kỹ Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy thuật huyết thanh học có nhiều nhược độ đặc hiệu của kỹ thuật nested RT-PCR điểm như chỉ có thể áp dụng ở tuổi thai > 100%. Kết quả phân tích trên các mẫu 22 tuần, tỷ lệ âm tính giả vẫn còn cao do virut khác gây triệu chứng phát ban như nồng độ kháng thể thấp trong máu cuống Rubella không có phản ứng chéo với rốn của thai nhi và bắt buộc phải lấy máu những loại virut này. Phản ứng chéo cuống rốn của thai nhi, kỹ thuật phức tạp không xảy ra ở cả virut có bản chất ARN nên chỉ được tiến hành tại một số ít bệnh giống Rubella và ADN không giống Rubella. viện chuyên khoa về sản khoa [6]. Các nghiên cứu khác trên thế giới cũng Nested RT-PCR có nhiều ưu điểm so cho thấy nested RT-PCR có độ đặc hiệu với cả phương pháp phân lập virut và cao (100%) [6]. phương pháp huyết thanh học về cả độ 3. Phạm vi áp dụng của kỹ thuật chính xác, thời gian trả kết quả nhanh hơn, nested RT-PCR trong chẩn đoán Rubella. đặc biệt, có thể áp dụng trong chẩn đoán Nested RT-PCR chẩn đoán dựa trên trước sinh nhiễm Rubella bẩm sinh trên cơ sở xác định vật chất di truyền của virut mẫu dịch ối. Kỹ thuật có độ đặc hiệu cao Rubella. Kỹ thuật này có thể tiến hành trên và độ nhạy tốt hơn kỹ thuật RT-PCR [10]. nhiều loại mẫu khác nhau: mẫu máu, mẫu KẾT LUẬN dịch họng, mẫu thủy tinh thể ở trẻ sơ sinh Qua nghiªn cøu trªn 120 mÉu kết quả trong chẩn đoán sau sinh và mẫu dịch ối cho thấy kỹ thuật nested RT-PCR có độ trong chẩn đoán trước sinh. nhạy và độ đặc hiệu 100%. Kỹ thuật có Theo Bosma và CS (1995), nested RT- thể được sử dụng phục vụ kiểm soát dịch PCR là phương pháp chẩn đoán nhanh, Rubella ở mức độ phân tử. với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, xác định 23
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Duy Bắc và CS. Nghiên cứu xác 8. Kiyoko O et al. Development of a novel định ARN virut Rubella bằng kỹ thuật nested TaqMan RT-PCR assay for detecting rubella RT-PCR. Tạp chí Y học Việt Nam. 2013, 470, virus RNA. Journal of Virological Methods. tr.138-142. 2011, 168, pp.267-271. 2. Nguyễn Văn Thường, Triệu Thị Thái, 9. Kazumi K, Kaneko M, Sameshima H et Phùng Nhã Hạnh, Nguyễn Văn Bàng. Hội chứng al. Rubella outbreak on Tokunoshima Island in Rubella bẩm sinh tại Hà Nội sau vụ dịch đầu 2004: a population-based study of pregnant năm 2011. Tạp chí Nghiên cứu Y học. 2012. women. J Obstet Gynaecol Res. 2010, 36 (5), 4. Nguyễn Vũ Trung. Virut Rubella. Vi sinh pp.938-943. y học. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2007, 10. Thanapal AR et al. Laboratory confirmation tr.304-307. of congenital Rubella syndrome in infants: An 5. Banatvala J. E., Brown D. W. Rubella. eye hospital based investigation. Journal of Lancet. 2004, 363 (9415), pp.1127-37. Medical Virology. 2008, 80, pp.536-546. 6. Bosma T. J, Corbett K. M, Eckstein M. B, 11. WHO. Controlling rubella and preventing O'Shea S, Vijayalakshmi P, Banatvala J. E, congenital Rubella syndrome - global progress. Morton K, Best J. M. Use of PCR for prenatal 2009. Wkly Epidemiol Rec. 2010, 85 (42), and postnatal diagnosis of congenital rubella. J pp.413-418 Clin Microbiol. 1995, 33 (11), pp.2881-2887. 7. Cutts F. T, Robertson S. E, Diaz-Ortega J. L, Samuel R. Control of Rubella and congenital Rubella syndrome (CRS) in developing countries. Part 1: Burden of disease from CRS. Bull World Health Organ. 1997, 75 (1), pp.55-68. 24