Định lượng phyllanthin trong diệp hạ châu đắng (phyllanthus amarus l.) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng sử dụng detector huỳnh quang

Nội dung text: Định lượng phyllanthin trong diệp hạ châu đắng (phyllanthus amarus l.) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng sử dụng detector huỳnh quang

1. TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 ĐỊNH LƢỢNG PHYLLANTHIN TRONG DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus L.) BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG Trần Thu Huyền*; Chử Đức Thành*; Vũ Tuấn Anh* Bùi Thị Bích Vân*; Chử Văn Mến* TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng phyllanthin trong dược liệu Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) sử dụng detector huỳnh quang. Phương pháp: định lượng phyllanthin bằng UPLC kết hợp detector huỳnh quang sử dụng cột sắc ký pha đảo C18, thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH. Kết quả: điều kiện sắc ký gồm: cột C18 (1,6 µm, 2,1 x 50 mm), hệ dung môi acetonitril:nước với tỷ lệ 55:45 (v/v), tốc độ dòng 0,3 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 2 µl; bước sóng kích thích và phát xạ huỳnh quang 230 và 340 nm; phương pháp được thẩm định với các tiêu chí: tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác. Các tiêu chí đều đáp ứng yêu cầu của phương pháp định lượng theo quy định. Áp dụng phương pháp phân tích trên mẫu dược liệu Diệp hạ châu đắng xác định được hàm lượng phyllanthin đạt 0,63%. Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng phyllanthin trong Diệp hạ châu đắng bằng UPLC kết hợp detector huỳnh quang. * Từ khóa: Diệp hạ châu đắng; Phyllanthin; Sắc ký lỏng siêu hiệu năng; Huỳnh quang. Quantitative Analysis of Phyllanthin in Phyllanthus Amarus L. using Ultra-performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector Summary Objectives: To develop and validate a method for quantitative analysis of phyllanthin in Phyllanthus amarus using ultra-performance liquid chromatography (UPLC) with fluorescence detector (UPLC-FD). Methods: Quantitative analysis of phyllanthin using UPLC-FD with reversed phase C18 column; the validation of method was in accordance with ICH guideline. Results: The chromatographic condition was developed including C18 column (1.6µm, 2.1 x 50 mm), solvent system including acetonitrile:water with ratio of 55:45 (v/v), flow rate of 0.3 mL/min, injection volume of 2 µL; the excitation and emission wavelengths are 230 and 340 nm, respectively; the method was validated with system suitability, specificity, linear range, precision and accuracy. All the parameters were met ICH guideline for method validation. The validated method was then applied for quantitation of phyllanthin in Phyllanthus amarus samples , the mean content of phyllanthin was 0.63% on dry basis. Conclusion: The quantitative analysis method of phyllanthin in Phyllanthus amarus using UPLC-FD has been developed and validated. * Keywords: Phyllanthus amarus; Phyllanthin; Ultra-performance liquid chromatography; Fluorescence detection. * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/12/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 31/01/2018 Ngày bài báo được đăng: 05/03/2018 26
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 ĐẶT VẤN ĐỀ - Diệp hạ châu đắng được thu hái tại khu vực Ba Vì (Hà Nội) vào tháng 5 - 2017. Diệp hạ châu đắng, còn gọi là Chó đẻ Mẫu được lưu trữ, xử lý và bảo quản tại răng cưa, Chó đẻ thân xanh, là dược liệu Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, được trồng, mọc hoang và được sử dụng Học viện Quân y. khá phổ biến ở Việt Nam với công dụng * Thiết bị: như: thông tiểu, chữa viêm họng, các bệnh gan do virut B [1, 2]. Thành phần hóa học - Hệ thống máy UPLC UPLC ACQUITY của Diệp hạ châu đắng gồm có lignan H-Class (Hãng Waters, Mỹ) kết hợp detector (phyllanthin, hypophyllanthin) [3] và flavonoid. huỳnh quang FLR ACQUITY (Hãng Waters, Phyllanthin là một thành phần chính trong Mỹ). Cột sắc ký CORTECS UPLC® BEH C18 cây Diệp hạ châu đắng có nhiều tác dụng (1,6 µm, 2,1 x 50 mm) (Hãng Waters, Mỹ). như: bảo vệ tế bào gan và ức chế virut - Cân phân tích MS 205 DU (Hãng viêm gan B [4], chống oxy hóa, làm giảm Mettler Toledo, Thụy Sỹ). Tủ sấy UN110 lượng axít uric trong chứng tăng uric máu, (Hãng Memmert, Đức). Bể siêu âm S-450H chống viêm [7]. Lữ Thị Kim Chi và (Hãng Elma, Đức). Các dụng cụ phân tích Nguyễn Ngọc Vinh đã phân lập và sử khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm. dụng phyllanthin làm chất chuẩn đánh 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. dấu cho dược liệu này [4]. * Điều kiện sắc ký: Có nhiều nghiên cứu định lượng Hệ thống phân tích UPLC cao ACQUITY phyllanthin trong Diệp hạ châu đắng bằng UPLC H-Class với buồng tiêm mẫu tự động, sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp detector có 4 kênh dung môi, detector huỳnh quang. UV và PDA [3, 6, 7, 8]. Tuy nhiên, các Thực hiện phân tích trên cột CORTECS phương pháp này cho giới hạn phát hiện UPLC® BEH C18 (1,6 µm, 2,1 x 50 mm), cao và thời gian phân tích mẫu kéo dài. nhiệt độ kiểm soát 300C. Pha động bao Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành gồm dung môi A (nước) và dung môi B xây dựng phương pháp định lượng phyllanthin (acetonitrile) được sử dụng theo chương trong Diệp hạ châu đắng sử dụng UPLC trình rửa giải đẳng dòng, tốc độ rửa giải với detector huỳnh quang giúp rút ngắn 0,3 ml/phút. Theo dõi sắc đồ ở các bước thời gian và tăng độ nhạy phân tích. sóng 230 và 340 nm trong toàn bộ thí nghiệm, xử lý bằng phần mềm Empower 3.0. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP * Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử: NGHIÊN CỨU Chuẩn bị dung dịch chuẩn: hòa tan 1. Hóa chất và thiết bị. phyllanthin chuẩn trong methanol được * Hóa chất và nguyên liệu: dung dịch chuẩn gốc 1,0 mg/ml. Chuẩn bị - Chất chuẩn phyllanthin (độ tinh khiết dung dịch chuẩn làm việc bằng cách pha ≥ 95%) đạt tiêu chuẩn USP (Hãng Sigma loãng dung dịch chuẩn gốc tới nồng độ Aldrich, Mỹ). Acetonitril, methanol (Hãng thích hợp của chất chuẩn trong methanol. Merck, Đức). Nước cất đạt tiêu chuẩn Chuẩn bị mẫu thử [8]: cân chính xác phân tích HPLC. Các hóa chất, dung môi 200 mg dược liệu, tiến hành chiết siêu âm khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. với 5 x 15 ml methanol trong 30 phút ở 27
3. TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 nhiệt độ 450C, gộp dịch chiết. Mẫu dịch nhiễu nền thấp thể hiện qua sắc ký đồ chiết được pha loãng 20 lần, lọc qua màng của mẫu chuẩn phyllanthin và mẫu thử 0,45 µm, phân tích sắc ký. Diệp hạ châu đắng. Thẩm định phương pháp phân tích: theo Bảng 1: Kết quả khảo sát hệ pha động hướng dẫn của ICH với các tiêu chí về rửa giải phyllanthin. tính tương thích, tính tuyến tính, độ đúng, Độ phân giải Hệ số bất Hệ pha động độ lặp lại, giới hạn phát hiện [5]. (Rs) đối (T) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN CAN:nước 45:55 1,81 ± 0,16 1,25 ± 0,02 CAN:nước 55:45 2,23 ± 0,11 1,04 ± 0,01 1. Kết quả khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký. CAN:nước 65:35 1,92 ± 0,09 1,16 ± 0,03 CAN:nước 75:25 1,78 ± 0,12 1,11 ± 0,02 Tiến hành xử lý mẫu và khảo sát điều kiện sắc ký theo phương pháp nghiên cứu, Thành phần rửa giải pha động được thu thập sắc đồ và phân tích kết quả. khảo sát cho thấy với hệ dung môi ACN 80.00 và nước (tỷ lệ 55:45) cho hệ số rửa giải cao 70.00 a và hệ số bất đối thấp của píc phyllanthin 60.00 3 . 1 5 2 50.00 trên sắc đồ. Phyllanthin 40.00 EU 30.00 2. Kết quả thẩm định phƣơng pháp. 20.00 * Tính thích hợp của hệ thống sắc ký: 10.00 0.00 Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 Minutes sắc ký, pha mẫu chuẩn theo chỉ dẫn, tiêm 50.00 45.00 6 lần mẫu chuẩn vào hệ thống UPLC, tiến 40.00 b 35.00 hành sắc ký với điều kiện đã chọn. 30.00 25.00 Bảng 2: Kết quả khảo sát tính thích hợp EU Phyllanthin 20.00 3 . 1 5 3 của hệ thống. 15.00 10.00 Thời Số đĩa lý Hệ số 5.00 Mẫu Diệp hạ Diện tích gian lƣu thuyết bất đối 0.00 châu đắng píc (µV.s) (phút) (n) (T) -5.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 Minutes 1 3,152 282.034 3.757 1,10 Hình 1: Sắc ký đồ của chuẩn phyllanthin 2 3,154 283.654 3.760 1,06 1.000 ng/ml (a) và mẫu Diệp hạ châu đắng (b). 3 3,156 282.069 3.752 1,04 Lựa chọn điều kiện sắc ký UPLC-FLD 4 3,154 281.696 3.745 1,09 để định lượng phyllanthin bao gồm: cột sắc 5 3,151 282.145 3.761 1,12 ® ký CORTECS UPLC BEH C18 (1,6 µm, 6 3,154 281.369 3.749 1,11 2,1 x 50 mm), hệ dung môi rửa giải Trung bình 3,153 282.161 3.754 1,09 acetonitrile:nước 55:45 (v/v), tốc độ dòng SD 0,00 787 6 0,03 0,3 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 2 µl; bước RSD (%) 0,06 0,28 0,17 2,83 sóng kích thích và phát xạ huỳnh quang Các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và 230 nm và 340 nm. Với phương pháp xử hệ thống UPLC sử dụng là phù hợp và lý mẫu và điều kiện sắc ký đã lựa chọn, đảm bảo tính ổn định của phép phân tích sắc ký đồ thu được cho các píc tách rõ ràng, định lượng phyllanthin. 28
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 * Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: Một dãy gồm 6 dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau, thay đổi từ 10 - 1.000 ng/ml đối với phyllanthin, tiến hành sắc ký như điều kiện đã mô tả. y = 2669X + 9886 R2 = 0.9991 Hình 2: Đường chuẩn của phyllanthin. Để xác định giới hạn phát hiện, tiến hành pha loãng mẫu chuẩn liên tục. Giá trị giới hạn phát hiện được xác định tại nồng độ có tỷ lệ giá trị tín hiệu/nhiễu nền là 3/1 và giới hạn định lượng được xác định tại nồng độ có tỷ lệ tín hiệu/nhiễu nền là 10/1. Bảng 3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, giới hiện phát hiện, giới hạn định lượng. Giới hạn Gi ớ i h ạn định Khoảng tuyến tính Phƣơng trình H ệ số Thông số phát hiện LOD lƣợng LOQ (ng/ml) tuyến tính tƣơng quan (R2) (ng/ml) (ng/ml) Phyllanthin 10 - 1.000 Y = 2.669X + 9.886 0,9991 2,1 7,0 Kết quả khảo sát cho thấy, với khoảng nồng độ phyllanthin từ 10 - 1.000 ng/ml, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc chuẩn tương ứng. Từ phương trình tuyến tính của phyllanthin cho phép xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng hoạt chất này lần lượt là 2,1 và 7,0 ng/ml. * Độ đúng và độ lặp lại: Độ đúng: tiến hành phân tích 6 mẫu thử độc lập với chất chuẩn thêm vào tương ứng với nồng độ 700 ng/ml. Tính lượng thu hồi theo công thức: tỷ lệ thu hồi (%) = (lượng chất phân tích tìm lại x 100)/lượng chất chuẩn thêm vào. Độ lặp lại: định lượng 6 mẫu thử độc lập lặp lại trong cùng ngày. Xác định giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD). 29
5. TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 Bảng 4: Kết quả xác định độ đúng. STT Chuẩn thêm vào (ng/ml) Chuẩn tìm lại (ng/ml) Tỷ lệ chuẩn tìm lại (%) 1 700,0 720,3 102,9 2 700,0 691,6 98,8 3 700,0 693,0 99,0 4 700,0 693,7 99,1 5 700,0 714,7 102,1 6 700,0 690,9 98,7 Trung bình 100,1 RSD (%) 1,88 Bảng 5: Kết quả xác định độ lặp lại. Lần Khối lƣợng cân (g) Diện tích píc (µV.s) Hàm lƣợng (%) 1 1,0025 1.813.565 0,67 2 1,0102 1.702.565 0,63 3 1,0062 1.697.543 0,63 4 1,0029 1.805.463 0,67 5 1,0095 1.703.254 0,63 6 1,0074 1.693.551 0,63 Trung bình 0,64 RSD (%) 3,60 Kết quả xác định độ đúng và độ lặp lại cho thấy phương pháp có độ đúng và độ lặp lại tốt với các giá trị RSD tương ứng 1,88% và 3,60%. * Áp dụng định lượng phyllanthin trong mẫu dược liệu Diệp hạ châu đắng: Dược liệu Diệp hạ châu đắng được định lượng phyllanthin theo quy trình đã xây dựng và thẩm định ở trên. Tiến hành phân tích mẫu lặp lại 10 lần. Kết quả cho thấy, hàm lượng trung bình của phyllanthin là 0,63% trong dược liệu khô. Hàm lượng hoạt chất chính trong các mẫu Diệp hạ châu đắng không biến động nhiều trong các mẫu. Bảng 6: Kết quả phân tích hàm lượng hoạt chất trong các mẫu Diệp hạ châu đắng. Hàm lƣợng phyllanthin trong mẫu Mẫu Khối lƣợng cân (g) Diệp hạ châu đắng (%) 1 1,0021 0,69 2 1,0054 0,65 3 0,9652 0,65 4 1,0123 0,68 5 1,0356 0,60 30
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 6 0,9451 0,63 7 0,9862 0,59 8 1,0829 0,60 9 1,0685 0,59 10 0,9865 0,65 Trung bình 0,63 SD 0,04 RSD (%) 5,97 KẾT LUẬN 3. Nguyễn Thị Thu Hà. Xây dựng và thẩm Phương pháp UPLC đơn giản, hiệu định phương pháp định lượng phyllanthin trong quả đã được xây dựng và thẩm định để Diệp hạ châu và các sản phẩm có chứa Diệp hạ châu. Tạp chí Dược liệu. 2011, tr.39-43. định lượng phyllanthin trong Diệp hạ châu đắng. Kết quả định lượng các mẫu Diệp 4. Lữ Thị Kim Chi, Nguyễn Ngọc Vinh. hạ châu đắng cho thấy: hàm lượng của Phân lập và thiết lập chất chuẩn phyllanthin từ phyllanthin đạt 0,63% và không có sự cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum et Thonn. Tạp chí Dược học. 2012, biến động nhiều trong các mẫu (RSD < 7%); tr.163-166. thời gian rửa giải của phyllanthin là 3,15 phút; giới hạn định lượng 7,0 ng/ml; 5. ICH guidelines. Validation of analytical procedures: Text and Methodology. Q2R1. 2005. phương pháp đã rút ngắn thời gian phân tích và cải thiện được giới hạn phát hiện. 6. Anupam Sharma, Ravneet T Singh, Đây là cơ sở để áp dụng phương pháp Sukhdev S Handa. Estimation of phyllanthin and hypophyllanthin by high performance trong nghiên cứu dược động học của liquid chromatography in Phyllanthus amarus. phyllanthin trên động vật. Phytochemical Analysis. 1993, pp.226-229. TÀI LIỆU THAM KHẢO 7. Van Tang Nguyen, Jennette A Sakoff, Christopher J Scarlett. Physicochemical properties, 1. Đỗ Tất Lợi. Những cây thuốc và vị thuốc antioxidant and cytotoxic activities of crude Việt Nam. NXB Khoa học và Kỹ thuật. 1995, extracts and fractions from Phyllanthus amarus. tr.133. Medicines. 2017, pp.1-15. 2. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, 8. Vikneswaran Murugaiyah, Kit-Lam Chan. Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Determination of four lignans in Phyllanthus Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, niruri L. by a simple high-performance liquid Nguyễn Tập, Trần Toàn. Cây thuốc và động chromatography method with fluorescence vật làm thuốc ở Việt Nam. NXB Khoa học và detection. Journal of Chromatography. 2007, Kỹ thuật. 2004, tập I, tr.675. 1154, pp.198-204. 31