Định lượng metformin trong huyết tương chó bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Định lượng metformin trong huyết tương chó bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ĐỊNH LƯỢNG METFORMIN TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO *; Nguyễ ă **; ũ uấn Anh** *; u ***; u ** TÓM TẮT o fortis phenyl (5 µm, 1 - 2HPO4 - 2 µg/m - - 97, - - 103,29%. ể ử ự * ừ DETERMINATION OF METFORMIN IN DOG PLASMA BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY SUMMARY Metformin is an oral biguanide medication, it has effective in reducing blood glucose levels in patients with type 2 diabetes. The aim of this study was to validate the analytical method of metformin in dog plasma by high pressure liquid chromatography (HPLC) with detector UV (at 232 nm) using ranitidin as an intenal standard. After precipating protein in plasma by acetonitrile, metformin and internal standard were eluted from fortis phenyl column (5 m, 150 x 4.6 mm) at 25C with a mobile phase consisting of acetonitrile and 20 mM Na2HPO4 (60:40, v/v), at a flow rate of 1.0 ml/min. The lower limit of quantitation was 0.05 µg/ml, with a relative standard deviation of less than 20%. A linear range of 0.05 - 2 µg/ml was established. This HPLC method was validated with between - batch and within - batch precision of 2.70 - 6.35% and 3.59 - 6.76%, respectively. The between - batch and within - batch accuracy was 97.43 - 100.96% and 94.62 - 103.29%, respectively. This validated method is sensitive and repeatable enough to be used in bioavailability studies in dogs. * Key words: Metformin; Plasma; HPLC. * Trường Cao đẳng Dược Phú Thọ ** Học viện Quân y *** Trường Đại học Dược Hà Nội N ờ p ả ồ (C esp d ): N uyễ ă ( v@ a l.c ) N y ậ b : 12/08/2014; N y p ả b đá á b bá : 16/09/2014 N y b bá đ ợc đă : 25/09/2014 13
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ĐẶT VẤN ĐỀ c ký l ng hi W ), detector UV, máy ly tâm l nh UNIVERSAL c), t l nh âm sâu DF8514 (Ilshinlab, Hàn Qu c). K ô ô P ừ X ự ô q ì ử ô Ở q ì ô ng d n c F A ặc hi u, ừ ặ [ ] gi i h tuy n tính, t l thu h [ ] KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ ọ BÀN LUẬN [ ] 1. K t quả q ì ọ q Q ự Kỳ ng metformin F A Vì ậ ô trong huy c xây dựng ể ữ L y 0,2 ml huy u tr ng/chu n/ thử) cho vào ng ly tâm. Thêm 50 µl dung ô é d ch ranitidin 7,5 µg/ml (n i chu n) và 50 µl c c t; 0,4 ml dung d ch acetonitril, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP l , ly tâm 10.000 NGHIÊN CỨU vòng/phút trong 10 phút. L y d ch n i, lọc N qua màng lọc 0,45 m. D ch lọ c p ể tiêm s c ký. ng vật thí nghi m, Học vi n Quân y K q ự ọ cung c p. c t fortis phenyl (5 m, 150 x 4,6 mm). Nhi c t: 25 ng: acetonitril - chu n do Vi n Kiểm nghi W m Na2NPO4 cung c ữ -250 ử (v/v). T dòng 1,0 ml/phút. Detector UV c c t c sóng 232 nm. Thể tích tiêm (HPLC-Merck), các dung môi hoá ch t khác m u: 50 l. N i chu n ranitidin có n ng t tiêu chu n PA. 7,5 g/ml. 14
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 K ả nh * Độ đặc hiệu - chọn lọc: Phân tích các m u huy ng và huy n (0,05 µg/ml) và n i chu n ranitidin (7,5 µg/ml). b a Hình 1: S m u huy ng (a) và s m u huy a metformin và ranitidin (b). ô ự q UV ể ẳ 3.107 Peak 1 322.7 3.092 Peak 1 0.014 227.9 233.8 a 0.12 0.012 a b 0.10 0.010 0.008 0.08 AU 0.006 AU 0.06 0.004 0.04 0.002 0.02 391.8 0.000 0.00 200.00 250.00 300.00 350.00 200.00 250.00 300.00 350.00 nm nm Hình 2: Ph h p th c a các pic có tR = 3,33 (ranitidin-a) và tR = 4,26 (metformin-b). Bảng 1: K t qu kiể ặc hi u - chọn lọc c DiÖn tÝch pic mÉu tr¾ng (mAU*s) Tû lÖ ®¸p øng pic STT Rt từ 4,0 - 4,4 phút Rt từ 3,1 - 3,7 phút Tr ng/metformin Tr ng/ranitidin 1 328 - < 20% < 5% 2 - - < 20% < 5% 3 - 276 < 20% < 5% 4 - - < 20% < 5% 5 - 652 < 20% < 5% 6 - - < 20% < 5% (“-“: không có tín hiệu đáp ứng) 15
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 T i th ểm trùng v i th ô c ng pic c a m u tr ≤ n tích pic c a ọ ọ m u chu n (di n tích pic trung bình c a * Độ tuy n tính: m u chu n metformin có n g n gi i h i là 3.028 mAu.s). Trong kho ng th ừ 3,1 - 3,7 phút, di n tích pic m u tr ≤ n tích pic 1,0; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 µg/ml q n i chu n (di n tích pic ranitidin trung bình ì ự X 68.279 mAu.s). q ữ ậ metformin/ ậ metformin ranitidin. ảng : ự ữ . Tªn mÉu S1 S2 S3 S4 S5 S6 N thực (µg/ml) 1,95 0,98 0,44 0,22 0,11 0,05 Di n tích pic metformin (mAU.s) 154.984 80.963 33.419 16.853 7.086 1.549 Di n tích pic ranitidin (mAU.s) 70.580 74.280 70.937 74.727 71.096 69.951 T l di n tích chu n/n i chu n 2,196 1,090 0,471 0,226 0,100 0,022 ì i quy (Y = aX + b)* Y = 1,1438X - 0,0303; R2 = 0,998 N nh từ ng chu n 97,32 97,94 87,67 111,82 113,60 91,65 so v i giá tr thực (%) (*Y: tỷ lệ diện tích pic metformin/ranitidin; X: nồng độ metformin trong mẫu) ừ - q ữ q ừ ự - é - i v i n th p nh t và 85 - 115% cho các n còn l i). * i i hạn đ nh ượng dư i ( Q : X ng pic c a m u chu n, m u tr ng. Tính n metformin trong m u chu n từ t l di ng chu n; từ ng cách so sánh v i giá tr thực có trong m u. 16
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ảng : K q DiÖn tÝch pic (mAU.s) M u chu n (metformin 0,05 µg/ml) M u tr ng STT Metformin Ranitidin Rt từ 4,0 - 4,4 phút Rt từ 3,1 - 3,7 phút (Rt = 4,3 phút) (Rt = 3,3 phút) 1 2.483 68944 328 - 2 3.764 64835 - - 3 3.051 68432 - 276 4 3.742 68211 - - 5 3.471 68552 - 652 X 3.302 SD 541 RSD (%) 16,37 ặ ậ ọ * Độ đúng độ chính ác trong ngày và * Tỷ ệ thu hồi: khác ngày: X nh t l thu h i c a ch t chu n Ti ể và n i chu n b ng cách so sánh di n tích 3 m c n LQC (0,15 µg/ml), MQC pic c a metformin và ranitidin từ m u huy t i di n tích pic c a chúng trong (0,4 µg/ml) và HQC (1,5 µ m u ph ng có ch a cùng n K Q ậ q l ặ 90,23% (n = 4), c a metformin các n ng ử LQC, MQC và HQC l t là 70,94%, ữ ự ọ K q ặ D < 5% - v i n i chu n, RSD < 10% v i chu n). 100,96% (n m trong gi i h é * Độ n đ nh: - - - ch chu n g c, é n i chu n g - - ể q nhi -800 i ọ v i metformin và -200 i v i ranitidin. 17
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ảng : nh th i gian ng n c a dung d ch chu n và n i chu n g c. KÕt qu¶ ®Þnh l•îng Giai ®o¹n STT Chu n g c (mAU.s) N i chu n g c (mAU.s) Th ng kê Th ng kê B o qu n l nh 1 12.896 X = 12877 83.551 X = 86.893 2 13.525 SD = 904,8 87.965 SD = 2.265,6 3 11.591 87.526 4 13.495 88.530 Sau 4 gi /25oC 1 12.759 X = 12635 85.609 X = 83.952 2 12.784 SD = 580,2 83.628 SD = 2.931,6 3 13.181 p = 0,668 86.606 p = 0,164 4 11.814 79.966 N trung bình c a dung d ch chu n g c và n i chu n g ể nhi phòng và b o qu n l ô ĩ > ậy, dung d ch chu n g c và dung d ch n i chu n g c b n vững u ki n nhi phòng trong vòng 4 gi . - nh n c ch t có trong các m u ki ọn t i th ểm ngay sau khi pha và sau khi b o qu n l nh từ 1 - 20 ngày -80o i v i metformin và -20o i v i ranitidin. Bảng 5: . KÕt qu¶ ®Þnh l•îng trung b×nh (n = 4) Giai ®o¹n Chu n g c (1.000 µg/ml) N i chu n g c (1.500 µg/ml) u X SD 1.000 32,06 X SD 1.500 59,75 X SD 973,80 15,23 X SD 1.575,76 58,01 Sau 3 ngày p0 - 3 0,190 p0 - 3 0,119 X SD 974,29 4,16 X SD 1.491,99 11,85 Sau 5 ngày p0 - 5 0,163 p0 - 5 0,801 X SD 952,66 29,18 X SD 1.465,02 11,37 Sau 7 ngày p0 - 7 0,072 p0 - 7 0,294 X SD 1.033,91 21,02 X SD 1.449,47 32,80 Sau 9 ngày p0 - 9 0,127 p0 - 9 0,189 X SD 970,19 38,33 X SD 1.479,82 20,43 Sau 20 ngày p0 - 15 0,278 p0 - 15 0,546 - nh c a m u huy ỳ ô - ô 18
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ảng 6: K q ỳ ô - ô Nång ®é metformin (µg/ml) Giai ®o¹n STT M u LQC M u HQC N Th ng kê N Th ng kê 1 0,171 X = 0,165 0,170 X = 1,302 Phân tích ngay 2 0,170 SD = 0,010 0,165 SD = 0,010 u) 3 0,149 0,172 4 0,169 0,157 1 1,292 X = 0,166 1,285 X = 1,308 Sau 3 chu kỳ ô - 2 1,297 SD = 0,006 1,349 SD = 0,028 ô 3 1,312 p = 0,831 1,299 p = 0,746 4 1,310 1,296 ỳ ô - ô > - q ì ử o sánh n metformin trong các m u LQC, HQC xử lý m q ì c lựa chọ ể tan ch y hoàn toàn nhi phòng, các m u LQC, HQC có cùng n ti n hành xử lý m ể tan ch y nhi phòng 4 gi . Bảng 7: q ì ử Nång ®é metformin (µg/ml) Giai ®o¹n STT M u LQC M u HQC N Th ng kê N Th ng kê 1 0,171 X = 0,165 1,292 X = 1,302 2 0,170 SD = 0,010 1,297 SD = 0,010 M c xử lý ngay 3 0,149 1,312 4 0,169 1,310 1 0,165 X = 0,167 1,303 X = 1,320 M c xử lý sau 4 2 0,169 SD = 0,002 1,310 SD = 0,016 gi ể tan ch y nhi t phòng 3 0,169 p = 0,697 1,331 p = 0,111 4 0,164 1,335 N metformin trong m Q Q c xử lý ngay so v i m c xử lý sau 4 gi ể tan ch y nhi ô ĩ ng kê (p > 0,05). - nh c a m u huy u LQC Q X nh n metformin có trong m u t i các th ểm ngay sau khi pha và sau 7, 17 và 27 ngày b o qu n m u -20oC. 19
8. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ảng 8: K q . Nång ®é metformin (µg/ml) Giai ®o¹n STT M u LQC M u HQC 1 0,157 X = 0,151 1,373 X = 1,434 2 0,149 SD = 0,005 1,553 SD = 0,101 M u 3 0,153 1,480 4 0,146 1,332 1 0,156 X = 0,159 1,366 X = 1,380 2 0,148 SD = 0,010 1,349 SD = 0,038 Sau 7 ngày 3 0,158 p = 0,221 1,371 p = 0,353 4 0,172 1,435 1 0,150 X = 0,154 1,510 X = 1,511 2 0,152 SD = 0,004 1,421 SD = 0,065 Sau 17 ngày 3 0,156 p = 0,377 1,571 p = 0,251 4 0,158 1,540 1 0,155 X = 0,161 1,333 X = 1,317 2 0,164 SD = 0,007 1,289 SD = 0,025 Sau 27 ngày 3 0,171 p = 0,060 1,343 p = 0,064 4 0,156 1,304 N metformin trong các m u b o qu n u ki n -20oC trong vòng 7, 17 và 27 ngày so v i n metformin trong m u m i pha khác bi ô ĩ th > ậy, metformin nh trong huy o u ki n b o qu n -20 C. KẾT LUẬN 0,45 m. D ch lọ ể Q và th tiêm s c ký. pháp ng metformin trong huy t phenyl (5  ự ọ q ì C. - ử ể Na2HPO4 0,02 M, y 0,2 ml huy UV (m u tr ng/chu n/thử) cho vào ng ly ể  tâm. Thêm 50 µl dung d ch ranitidin 7,5 µg/ml (n i chu n) và 50 µl c c t, 0,4 g/ml. ml acetonitril, l c xoáy 30 giây. Q ì ọ ự y d ch n i lọc qua màng lọc q 20
9. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 F A 3. Center for drug evaluation and ọ research. Guidance for industry, ậ ể q ì bioanalytical method validation. FDA, US, ể Department of Health and Human Service. é 2001. 4. Himal Paudel Chhetri. Simple HPLC- UV method for the quantification of TÀI LIỆU THAM KHẢO metformin in human plasma with 1. Dược thư quốc gia Việt Nam. Y one step protein precipitation. Saudi Pharmaceutical Journal. 2014, pp.1-5. . Thông tư hư ng dẫn báo cáo số iệu 5. Valentina Porta. HPLC-UV determintaion nghiên cứu sinh khả dụng/tương đương of metformin in human plasma for application in pharmacokinitics and sinh học trong đăng ký thuốc. Y bioequivalence studies. 2007, pp.143-147. 2010. 21
10. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 22