Định lượng doxorubicin trong huyết tương chuột bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Định lượng doxorubicin trong huyết tương chuột bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 ĐỊNH L ƯỢNG DOXORUBICIN TRONG HUY ẾT T ƯƠ NG CHU ỘT BẰNG S ẮC KÝ L ỎNG HI ỆU N ĂNG CAO Bùi Bá Minh* TÓM T ẮT Mục tiêu: xây d ựng và th ẩm đị nh ph ươ ng pháp định l ượng doxorubicin (DOX) trong huy ết tươ ng chu ột, ứng d ụng trong đánh giá sinh kh ả d ụng, t ươ ng đươ ng sinh h ọc c ủa các ch ế ph ẩm ch ứa DOX trên th ực nghi ệm. Ph ươ ng pháp: xây d ựng và th ẩm đị nh ph ươ ng pháp định l ượng DOX trong huy ết t ươ ng chu ột b ằng s ắc ký l ỏng hi ệu n ăng cao (HPLC) theo h ướng d ẫn c ủa FDA. Kết qu ả: đã xây d ựng được quy trình định l ượng DOX b ằng HPLC v ới các điều ki ện sau: xử lý m ẫu b ằng t ủa protein v ới acetonitril; c ột Gemini C18; 5 µm, 250 x 4 mm; pha động: acetonitril - amoni nitrat 0,25 g/l trong n ước v ới t ỷ l ệ 30:70 (v/v); t ốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector: PDA ở 232 nm; th ể tích tiêm m ẫu: 10 µl; th ời gian ch ạy: 10 phút; n ội chu ẩn là daunorubicin 8 µg/l. Ph ươ ng pháp có độ đặ c hi ệu, ch ọn l ọc t ốt, th ời gian l ưu c ủa DOX trung bình 3,5 phút, tách bi ệt h ơn daunorubicin v ới th ời gian l ưu trung bình 5,7 phút. M ẫu tr ắng có đáp ứng nh ỏ h ơn 5% so v ới m ẫu chu ẩn và n ội chu ẩn. Độ l ặp l ại t ốt v ới độ l ệch chu ẩn t ươ ng đối (RSD) trong ngày t ừ 2,1 - 3,8 % và khác ngày t ừ 3,62 - 4,68%. Độ đúng đạ t 91,7 - 98,4% v ới kho ảng n ồng độ t ừ 1 - 100 µg/l. Độ tuy ến tính t ừ 1 - 100 µg/l v ới R 2 là 0,9995. Gi ới h ạn đị nh lượng d ưới 1 µg/l. Ph ươ ng pháp x ử lý m ẫu có hi ệu su ất chi ết cao (94,2 - 98,8%) v ới RSD < 4%. Mẫu huy ết t ươ ng ổn đị nh sau 3 chu k ỳ đông - rã và trong quá trình x ử lý m ẫu. Kết lu ận: quy trình có th ể áp d ụng được để đị nh l ượng DOX trong huy ết t ươ ng chu ột. * T ừ khóa: Doxorubicin; Huy ết t ươ ng chu ột; S ắc ký l ỏng hi ệu n ăng cao. Determination of DOX Concentration in Mouse Plasma by High Performance Liquid Chromatography Summary Objectives: To develop and validate the method of DOX determination in mouse plasma to assess the bioavailability, the biological equivalence of the DOX-containing compositions. Methods: Development and validation a method of quantifying DOX in mouse plasma by HPLC according to FDA guidelines. Results: Analytical procedures: the sample is processed by precipitating the protein with acetonitrile. Column gemini C 18 , 5 µm, 250 x 4 mm; mobile phase: acetonitrile - ammonium nitrate 0.25 g/L in water at a ratio of 30:70 (v/v); flow rate: 1.0 mL/min; detector: PDA at 232 nm; injection volume: 10 µL; runtime: 10 minutes; internal standard is daunorubicin 8 µg/L. The method has a good selectivity, response of blank samples were 5% less than standard and internal standard samples. The precision was good with RSD intra-day and inter-day during the day ranged from 2.1 to 3.8% and day to day ranged from 3.62 to 4.68%. * B ệnh vi ện Quân y 103 Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Bùi Bá Minh (minh_phar@yahoo.com) Ngày nh ận bài: 11/04/2017; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 07/08/2017 Ngày bài báo được đă ng: 10/087/2017 154
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 The accuracy was 91.7 - 98.4% with concentrations ranging from 1 - 100 µg/L. The method has a linearity of 1 - 100 µg/L with R 2 of 0.998. LLOQ was 1 µg/L. The high extraction efficiency (94.2 - 98.8%) with RSD < 4% was obtained. Plasma samples were stable after 3 cycles of freezing and during sample processing. Conclusions: Analytical procedures should be applied to quantify DOX in mouse plasma. * Keywords: Doxorubicin; Mouse plasma; High performance liquid chromatography. ĐẶT V ẤN ĐỀ - Huy ết t ươ ng chu ột do Ban Cung c ấp Động v ật Thí nghi ệm, H ọc vi ện Quân y Y h ọc hi ện đạ i đang chú tr ọng đế n cung c ấp. hi ệu qu ả điều tr ị c ủa thu ốc đố i v ới t ừng bệnh nhân. Để làm được điều này, vi ệc - Ch ất chu ẩn DOX hydrochlorid USP RS, lô L0K258, hàm l ượng 99,8% và định l ượng n ồng độ thu ốc trong máu, d ịch daunorubicin hydrochlorid USP RS, lô sinh h ọc r ất c ần thi ết. DOX là thu ốc M1M099, hàm l ượng 99,5% do Vi ện Ki ểm ch ống ung th ư dùng ph ổ bi ến. Ph ươ ng nghi ệm Thu ốc TW cung c ấp. pháp định l ượng DOX trong ch ế ph ẩm đã có trong D ược điển M ỹ, nh ưng ch ưa có 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. ph ươ ng pháp định l ượng DOX trong d ịch * Xây d ựng ph ươ ng pháp phân tích: sinh h ọc [4]. Khó kh ăn c ủa vi ệc đị nh - Xây d ựng quy trình x ử lý m ẫu b ệnh lượng trong d ịch sinh h ọc là n ồng độ ph ẩm: kh ảo sát ph ươ ng pháp x ử lý mẫu, thu ốc th ấp và ảnh h ưởng c ủa môi tr ường. chi ết tách DOX để đị nh l ượng. Nghiên c ứu này nh ằm: Xây d ựng và th ẩm - Xác định điều ki ện s ắc ký: d ựa vào định ph ươ ng pháp định l ượng n ồng độ tài li ệu tham kh ảo và điều ki ện th ực t ế, DOX trong huy ết t ươ ng chu ột theo h ướng ti ến hành khảo sát các điều ki ện s ắc ký: dẫn c ủa FDA, ứng d ụng để đánh giá sinh cột s ắc ký, thành ph ần pha độ ng, ch ất n ội kh ả d ụng, t ươ ng đươ ng sinh h ọc c ủa các chu ẩn, th ể tích tiêm m ẫu, th ời gian tiêm ch ế ph ẩm ch ứa DOX trên th ực nghi ệm. mẫu để đị nh l ượng DOX trong d ịch sinh học. ĐỐI T ƯỢNG VÀ PH ƯƠ NG PHÁP * Th ẩm đị nh ph ươ ng pháp: NGHIÊN C ỨU Th ẩm đị nh ph ươ ng pháp định l ượng 1. Đối t ượng nghiên c ứu. ch ất trong d ịch sinh h ọc theo h ướng d ẫn Huy ết t ươ ng chu ột có ch ứa DOX. của FDA [3]. * Thi ết b ị và v ật li ệu: - Chu ẩn b ị: - H ệ th ống HPLC Alliance Waters 2695D, + Dung d ịch chu ẩn làm vi ệc DOX autosampler, detector PDA. Các máy ly (400 µg/ml, 200 µg/ml, 80 µg/ml, 40 µg/ml, tâm l ạnh, ly tâm th ường... 20 µg/ml, 8 µg/ml, 4 µg/ml) pha trong n ước. - Dung môi hóa ch ất đạ t chu ẩn phân + Dung d ịch n ội chu ẩn daunorubicin tích và chu ẩn cho HPLC. (DAU) có n ồng độ 40 µg/ml pha trong n ước. 155
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 + Mẫu tr ắng: huy ết t ươ ng tr ắng không thuy ết có trong m ẫu. Độ đúng c ủa ch ứa chu ẩn và n ội chu ẩn. ph ươ ng pháp t ại m ỗi n ồng độ ph ải n ằm + Mẫu n ội chu ẩn: huy ết t ươ ng tr ắng trong kho ảng 85 - 115%. không ch ứa chu ẩn, ch ỉ ch ứa n ội chu ẩn. - Hi ệu su ất chi ết: + M ẫu chu ẩn: pha loãng dung d ịch So sánh k ết qu ả đị nh l ượng các m ẫu chuẩn và n ội chu ẩn làm vi ệc v ới huy ết LQC; MQC và HQC cùng v ới m ẫu chu ẩn tươ ng tr ắng để thu được các m ẫu chu ẩn pha trong pha động (không qua chi ết ở n ồng độ thích h ợp. tách), có n ồng độ t ươ ng ứng. Hi ệu su ất + M ẫu QC (Quality Control): m ẫu QC chi ết ph ải không quá 110% và không th ấp chu ẩn b ị t ừ dung d ịch chu ẩn g ốc độ c l ập hơn 30%; RSD c ủa giá tr ị hi ệu su ất chi ết với dung d ịch chu ẩn g ốc dùng để pha tại các n ồng độ không quá 15% và hi ệu mẫu chu ẩn. su ất chi ết trung bình t ại các nồng độ khác * Kh ảo sát các ch ỉ tiêu th ẩm đị nh theo nhau không quá ± 15%. hướng d ẫn c ủa FDA: - Kho ảng tuy ến tính: - Tính đặc hi ệu, ch ọn l ọc: Phân tích các m ẫu chu ẩn DOX trong Ti ến hành s ắc ký các m ẫu tr ắng; m ẫu huy ết t ươ ng có n ồng độ t ừ 1/40 đế n 2 - 3 nội chu ẩn; m ẫu chu ẩn và m ẫu th ử. lần n ồng độ t ối đa d ự tính. H ệ s ố tươ ng Đáp ứng c ủa m ẫu tr ắng t ại th ời điểm quan gi ữa t ỷ l ệ đáp ứng píc c ủa trùng v ới th ời gian l ưu c ủa DOX, không DOX/DAU và n ồng độ DOX ph ải l ớn h ơn vượt quá 20% đáp ứng c ủa m ẫu chu ẩn. 0,98 và ít nh ất 75% s ố điểm c ủa đường Đáp ứng c ủa m ẫu tr ắng t ại th ời điểm chu ẩn, bao g ồm c ả m ẫu có n ồng độ th ấp trùng v ới th ời gian l ưu c ủa n ội chu ẩn ph ải nh ất và m ẫu có n ồng độ cao nh ất ph ải có không được v ượt quá 5% đáp ứng c ủa độ đúng n ằm trong kho ảng t ừ 85 - 115%, nội chu ẩn. riêng điểm th ấp nh ất c ủa đường chu ẩn cho phép sai s ố không quá 20%. - Độ l ặp l ại trong ngày, độ l ặp l ại khác ngày: - Gi ới h ạn đị nh l ượng d ưới (LLOQ): + Độ l ặp l ại trong ngày : đo QC ở Ti ến hành s ắc ký các m ẫu tr ắng và 3 m ức n ồng độ , m ỗi m ức n ồng độ ít nh ất mẫu chu ẩn có n ồng độ 1/10 - 1/30 C max . 5 m ẫu độ c l ập trong cùng m ột ngày. Giá Nồng độ được coi là gi ới h ạn đị nh l ượng tr ị RSD ph ải ≤ 15%. dưới n ếu trên s ắc ký đồ m ẫu chu ẩn ở + Độ l ặp l ại gi ữa các ngày: ti ến hành nồng độ đó cho píc DOX tách bi ệt v ới các tươ ng t ự nh ư xác định độ l ặp l ại trong píc t ạp, có độ đúng t ừ 80 - 120%; độ l ặp ngày, ít nh ất 3 ngày. Giá tr ị RSD ph ải ≤ 15%. lại v ới giá tr ị RSD ≤ 20% và đáp ứng píc DOX ≥ 5 l ần đáp ứng c ủa m ẫu tr ắng. - Độ đúng: - Độ ổn đị nh c ủa DOX trong huy ết Ti ến hành định l ượng các lô m ẫu QC ở tươ ng: 3 kho ảng n ồng độ th ấp (LQC), trung bình (MQC) và cao (HQC), m ỗi lô m ẫu g ồm ít Xác định độ ổn đị nh c ủa DOX sau nh ất 5 m ẫu độ c l ập. So sánh giá tr ị trung 3 chu k ỳ đông - rã đông; trong quá trình bình các l ần đị nh l ượng v ới giá tr ị lý xử lý m ẫu trên các m ẫu LQC và HQC. 156
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 + Độ ổn đị nh sau 3 chu k ỳ đông - rã: Qua tham kh ảo tài li ệu [1, 2, 4] và Bảo qu ản m ẫu ở nhi ệt độ -20 oC trong kh ảo sát, đã l ựa ch ọn được điều ki ện s ắc 24 gi ờ, l ấy m ẫu ra và để tan ở nhi ệt độ ký g ồm: phòng. Sau khi đã tan ch ảy hoàn toàn, để - C ột: Gemini C 18 ; 5 µm, 250 x 4 mm. mẫu tr ở l ại đông l ạnh trong 12 - 24 gi ờ. Nhi ệt độ c ột: 25 °C. Lặp l ại chu k ỳ đông - rã đông 2 l ần n ữa. - Pha động: acetonitril - amoni nitrat Ti ến hành phân tích m ẫu sau l ần để rã 0,25 g/l trong n ước v ới t ỷ l ệ 30:70 (v/v). đông th ứ 3. K ết qu ả l ượng DOX có trong +T ốc độ dòng 1,0 ml/phút. mẫu sau 3 chu k ỳ đông - rã đông và m ẫu + Detector: PDA ở 232 nm. phân tích tr ước khi để đông ph ải sai khác + Th ể tích tiêm m ẫu: 10 µl. không có ý ngh ĩa th ống kê. + Th ời gian ch ạy: 10 phút + Độ ổn đị nh trong quá trình x ử lý mẫu: So sánh n ồng độ DOX có trong m ẫu + N ội chu ẩn là DAU nồng độ trong được chi ết tách ngay sau khi rã đông và huy ết t ươ ng 8 µg/ml. mẫu có n ồng độ t ươ ng ứng ch ỉ được Với điều ki ện s ắc ký này, đã tách phân chi ết tách sau khi đã rã đông và để ở bi ệt được píc c ủa DOX và píc c ủa DAU nhi ệt độ phòng t ối thi ểu 4 gi ờ. K ết qu ả với h ệ s ố tách 1,64. Di ện tích píc c ủa ph ải sai khác không có ý ngh ĩa th ống kê. DOX trung bình 12.682 mAU.s và di ện tích píc c ủa DAU trung bình 133.176 KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU VÀ mAU.s ở m ẫu ch ứa 1 µg/ml chu ẩn DOX BÀN LU ẬN và 8 µg/ml n ội chu ẩn DAU. Các đáp ứng píc này l ớn h ơn 5 l ần so v ới m ẫu huy ết 1. Xây d ựng ph ươ ng pháp phân tươ ng tr ắng ( hình 1 ). tích. 2. Th ẩm đị nh ph ươ ng pháp phân * Quy trình x ử lý m ẫu: tích. - Chu ẩn b ị m ẫu: l ấy 0,2 ml huy ết t ươ ng * Độ đặ c hi ệu - ch ọn l ọc: cho vào ống ly tâm. Thêm 50 µl dung d ịch chu ẩn (ho ặc QC), l ắc xoáy trong 30 giây. Tiêm l ặp l ại 5 l ần m ẫu huy ết t ươ ng Thêm 50 µl dung d ịch DAU 40 µg/ml (n ội tr ắng, m ẫu huy ết t ươ ng ch ứa DOX chu ẩn), l ắc xoáy trong 30 giây. 3 µg/ml và DAU 8 µg/ml sau khi x ử lý mẫu theo quy trình đã l ựa ch ọn ở trên. - Chi ết tách DOX: thêm vào m ẫu phân Kết qu ả phân tích cho th ấy DOX có th ời tích 0,2 ml dung d ịch acetonitril, l ắc xoáy gian l ưu (t R) trung bình 3,46 phút, RSD trong 3 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút x 0,68%; DAU có th ời gian l ưu trung bình 10 phút. L ấy d ịch n ổi, l ọc qua màng 5,66 phút, RSD 0,19%. M ẫu tr ắng có đáp 0,45 µm. D ịch l ọc thu được dùng để tiêm ứng nh ỏ h ơn 5% so v ới m ẫu chu ẩn. Píc sắc ký. DOX có h ệ s ố đố i x ứng (SF) là 1,04; s ố * K ết qu ả l ựa ch ọn điều ki ện s ắc ký: đĩa lý thuy ết (N) 9.860. 157
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 0.030 a 0.025 0.020 0.015 0.010 AU 0.005 0.000 -0.005 -0.010 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 Minutes 0.030 b 0.025 0.020 5.692 0.015 DAU 0.010 AU 0.005 0.000 -0.005 -0.010 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 Minutes 0.030 c DOC 3.246 0.020 DAU 5.980 0.010 AU 0.000 -0.010 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 Minutes Hình 1: Sắc ký đồ huy ết t ươ ng tr ắng (a), huy ết t ươ ng có ch ứa n ội chu ẩn DAU (b), huy ết t ươ ng có ch ứa chu ẩn DOX và n ội chu ẩn DAU (c). 158
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 * Độ l ặp l ại, độ đúng: - Độ l ặp l ại, độ đúng trong ngày: Phân tích các m ẫu LQC (3 µg/ml), MQC (20 µg/ml) và HQC (80 µg/ml), m ỗi m ẫu 6 l ần trong ngày. Bảng 1 : K ết qu ả độ l ặp l ại, độ đúng trong ngày. Mẫu n Độ đúng trung bình SD RSD LQC 6 91,71% 1,94 2,11% MQC 6 98,37% 3,01 3,06% HQC 6 93,79% 3,55 3,78% Ph ươ ng pháp có độ đúng t ốt (91,71 - 98,37%); độ l ặp l ại trong ngày v ới giá tr ị RSD nh ỏ (2,1 - 3,8%), đáp ứng yêu c ầu v ề độ l ặp l ại, độ đúng c ủa ph ươ ng pháp phân tích trong d ịch sinh h ọc. - Độ l ặp l ại, độ đúng khác ngày: Phân tích các m ẫu LQC (3 µg/ml), MQC (20 µg/ml) và HQC (80 µg/ml), m ỗi m ẫu 5 l ần m ỗi ngày, trong 3 ngày. Bảng 2: Kết qu ả độ l ặp l ại, độ đúng khác ngày. Mẫu n Độ đúng trung bình SD RSD LQC 15 90,24% 3,35 3,71% MQC 15 99,70% 3,61 3,62% HQC 15 93,76% 4,39 4,68% Ở c ả 3 n ồng độ (3; 20 và 80 µg/ml), ph ươ ng pháp đều cho độ đúng 90,2 - 99,7% và độ l ặp l ại khác ngày v ới giá tr ị RSD < 10% (3,62 - 4,68%) ch ứng t ỏ ph ươ ng pháp nghiên c ứu có độ l ặp l ại, độ đúng cao, đáp ứng yêu c ầu đố i v ới ph ươ ng pháp dùng trong sinh h ọc. * Kho ảng tuyến tính: Phân tích các m ẫu chu ẩn DOX trong huy ết t ươ ng có n ồng độ 1; 2; 5; 10; 20, 50; 100 µg/ml, chu ẩn b ị theo quy trình đã xây d ựng. Xác đị nh m ối t ươ ng quan gi ữa n ồng độ DOX trong huy ết t ươ ng và t ỷ l ệ di ện tích píc DOX/DAU đo được. K ết qu ả được trình bày trong b ảng 3 và hình 2. 159
7. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 Bảng 3 : K ết qu ả kh ảo sát kho ảng tuy ến tính. Tên m ẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 Nồng độ (µg/ml) 1,0 2,0 5,0 10,0 20,0 50,0 100,0 Di ện tích píc DOX (mAU.s) 12682 27741 63892 134767 278820 745751 1482674 Di ện tích píc DAU (mAU.s) 133176 140509 143982 142302 139784 138313 142503 Tỷ l ệ di ện tích chu ẩn/n ội chu ẩn 0,095 0,197 0,444 0,947 1,995 5,392 10,405 Tỷ lệ di ện tích chu ẩn/ nội chu ẩn N ồng độ ( µg/l) Hình 2: Đồ th ị t ươ ng quan gi ữa n ồng độ DOX và t ỷ l ệ di ện tích píc DOX/DAU. Ph ươ ng pháp có kho ảng tuy ến tính t ừ 1,0 - 100,0 µg/l v ới h ệ s ố t ươ ng quan R2 0,9995. * Gi ới h ạn đị nh l ượng d ưới: Phân tích m ẫu tr ắng và m ẫu chu ẩn có n ồng độ th ấp nh ất trong kho ảng tuy ến tính (1 µg/ml). Xác định đáp ứng píc c ủa m ẫu chu ẩn, m ẫu tr ắng. Tính n ồng độ DOX trong mẫu chu ẩn t ừ t ỷ l ệ di ện tích DOX/DAU và đường chu ẩn. Bảng 4: K ết qu ả xác đị nh gi ới h ạn đị nh l ượng d ưới. Di ện tích píc (mAU.s) Stt Mẫu chu ẩn (1 µg/ml) Mẫu tr ắng DOX (R t = 3,5 phút) DAU (R t = 5,7 phút) 3,3 - 3,9 phút 5,4 - 5,8 phút 1 9.682 123.845 474 455 2 13.108 133.276 - 307 3 13.256 145.198 - 586 4 12.378 140.255 505 995 5 10.454 138.766 773 734 Trung bình 11.776 SD 1.617 RSD (%) 13,73 160
8. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 Tại v ị trí có th ời gian l ưu kho ảng 3,5 phút đáp ứng m ẫu chu ẩn có n ồng độ 1 µg/ml gấp h ơn 20 l ần đáp ứng c ủa m ẫu tr ắng và độ l ặp l ại sau 5 l ần phân tích v ới RSD < 20%. Nh ư v ậy, m ẫu chu ẩn ch ứa DOX có n ồng độ 1 µg/ml đáp ứng yêu c ầu gi ới h ạn định l ượng d ưới c ủa ph ươ ng pháp phân tích d ịch sinh h ọc. * Hi ệu su ất chi ết c ủa ph ươ ng pháp: Ti ến hành định l ượng các m ẫu LQC; MQC và HQC cùng v ới m ẫu chu ẩn pha trong pha động (không qua chi ết tách) v ới n ồng độ t ươ ng ứng. Bảng 5: Hi ệu su ất chi ết ở các kho ảng n ồng độ . Mẫu n Hi ệu su ất chi ết SD RSD LQC 5 94,20% 3,44 3,65% MQC 5 98,80% 3,92 3,97% HQC 5 97,57% 3,22 3,30% Ở c ả 3 kho ảng n ồng độ 3; 20 và 80 µg/ml, ph ươ ng pháp đều cho hi ệu su ất chi ết cao (t ừ 94,2 - 98,8%); độ l ặp l ại t ốt (RSD < 4%) và hi ệu su ất chi ết trung bình t ại các nồng độ chênh l ệch nhau không quá 5%. Do đó, ph ươ ng pháp x ử lý m ẫu được xây dựng phù h ợp để chi ết tách DOX t ừ huy ết t ươ ng chu ột. * Độ ổn đị nh c ủa DOX trong huy ết t ươ ng: - Độ ổn đị nh sau 3 chu k ỳ đông - rã đông: định l ượng DOX tr ước và sau 3 chu k ỳ đông - rã đông trên các m ẫu LQC và HQC. Bảng 6: Độ ổn đị nh sau 3 chu k ỳ đông - rã đông. Tr ước khi để đông Sau 3 chu k ỳ đông - rã đông Mẫu n p Trung bình SD Trung bình SD LQC 5 2,82 0,11 2,63 0,12 > 0,05 MQC 5 19,14 0,59 18,16 0,64 > 0,05 HQC 5 79,86 3,13 75,54 3,18 > 0,05 Sau 3 chu k ỳ đông - rã đông, định l ượng DOX ở c ả 3 m ức n ồng độ LQC, MQC và HQC đều khác bi ệt không có ý ngh ĩa th ống kê so v ới tr ước khi để đông. - Độ ổn đị nh trong quá trình x ử lý m ẫu: định l ượng DOX có trong m ẫu LQC, MQC, HQC tách chi ết ngay sau khi rã đông và m ẫu có n ồng độ t ươ ng ứng ch ỉ được chi ết tách sau khi đã rã đông, để ở nhi ệt độ phòng 4 gi ờ. 161
9. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2017 Bảng 7: Độ ổn đị nh trong quá trình x ử lý m ẫu. Ngay sau rã đông Sau rã đông 4 gi ờ Mẫu n p Trung bình SD Trung bình SD LQC 5 2,78 0,11 2,69 0,12 > 0,05 MQC 5 18,84 0,58 18,28 0,62 > 0,05 HQC 5 79,61 3,11 75,83 3,17 > 0,05 Hàm l ượng DOX ở c ả 3 m ức n ồng độ LQC, MQC và HQC đều ổn đị nh trong quá trình x ử lý m ẫu. Nh ư v ậy, nghiên c ứu đã xây d ựng được quy trình định l ượng DOX trong huy ết tươ ng chu ột. K ết qu ả th ẩm đị nh cho th ấy ph ươ ng pháp đạt yêu c ầu theo h ướng d ẫn của FDA. KẾT LU ẬN của các ch ế ph ẩm ch ứa DOX trên th ực nghi ệm. Đã xây d ựng được ph ươ ng pháp định lượng DOX trong huy ết t ươ ng chu ột b ằng TÀI LI ỆU THAM KH ẢO HPLC. Ph ươ ng pháp đã được th ẩm đị nh với các thông s ố theo h ướng d ẫn c ủa 1. Deng W.J, Zeng Z.L, Liang Y.J, Dai C.L, Zhang J.Y, Fu L.W . Detecting DOX concentration FDA và đạt yêu c ầu. Ph ươ ng pháp có độ in KBv200 and KB cell xenografts in nude đặc hi ệu v ới m ức đáp ứng c ủa m ẫu tr ắng mice by high-performance liquid chromatography. tại th ời điểm trùng v ới th ời gian l ưu c ủa Ai Zheng. 2008, Apr, 27 (4), pp.364-368. mẫu chu ẩn không quá 5%. Độ l ặp l ại 2. Kimberley M. Laginha, Sylvia Verwoert, trong ngày và khác ngày v ới độ l ệch Gregory J.R. Charrois and Theresa M. Allen. ẩ ươ đố đề ươ chu n t ng i u < 5%. Ph ng pháp Determination of DOX levels in whole tumor có độ đúng 90,2 - 99,7% ở c ả 3 m ức and tumor nuclei in murine breast cancer nồng độ th ấp, trung bình và cao. Kho ảng tumors. Clin Cancer Res. 2005, October 1, tuy ến tính c ủa ph ươ ng pháp t ừ 1 - 100 µg/l. 11, 6944. Gi ới h ạn đị nh l ượng d ưới 1 µg/l. Ph ươ ng 3. U.S. Department of Health and Human pháp x ử lý m ẫu cho hi ệu su ất chi ết cao Services. Food and drug administration. từ 94,2 - 98,8%. M ẫu huy ết t ươ ng ổn Center for Drug Evaluation and Research định sau 3 chu kỳ đông - rã đông và (CDER). Guidance for Industry Bioanalytical trong quá trình x ử lý m ẫu. Với k ết qu ả Method Validation. 2001. này, có th ể ứng d ụng trong đánh giá 4. USP 38-NF33 . DOX hydrochloride for sinh kh ả d ụng và t ươ ng đươ ng sinh h ọc injection. 2015. 162