Định lượng đồng thời dexamethason acetat, betamethason, prednisolon và triamcinolon trong mỹ phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Định lượng đồng thời dexamethason acetat, betamethason, prednisolon và triamcinolon trong mỹ phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI DEXAMETHASON ACETAT, BETAMETHASON, PREDNISOLON VÀ TRIAMCINOLON TRONG MỸ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Thị Xuyên*; Hoàng Việt Dũng*; Hoàng Mỹ Hạnh* Đào Văn Đôn*; Nguyễn Thị Thanh Phương** TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành nhằm xây dựng quy trình định lượng đồng thời đồng thời dexamethason acetat (DA), betamethason (BE), prednisolon (PR) và triamcinolon (TR) trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV, pha động ACN:H2O (45:55, v/v), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích bơm mẫu 50 µl. Quy trình định lượng này đã được thẩm định đầy đủ. Trong khoảng nồng độ 1 - 50 g/ml, diện tích pic và nồng độ có tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ~ 1. Giới hạn định lượng của 4 chất DA, BE, PR và TR lần lượt là 0,25 g/ml; 0,36 g/ml; 0,30 g/ml và 0,33 g/ml. Độ lặp lại < 3%, độ đúng 93 - 99%. Quy trình này có thể ứng dụng để kiểm tra DA, BE, PR và TR trong mỹ phẩm trên thị trường. * Từ khóa: Sắc ký lỏng hiệu năng cao; Glucocorticoid; Dexamethason acetat; Betamethason; Prednisolon; Triamcinolon; Mỹ phẩm. SIMULTANEOUS DETERMINATION OF DEXAMETHASONE ACETATE, BETAMETHASONE, PREDNISOLONE AND TRIAMCINOLONE IN COSMETICS BY HPLC SUMMARY A HPLC method for the simultaneous determination of 4 glucocorticoids (dexamethasone acetate, betamethasone, prednisolone and triamcinolone) in cosmetics was validated. Using acetonitrile and water as the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6 nm, 5 µm) column, UV detection at 240 nm and flow at 1.0 ml/min. The quantitation limits of dexamethasone acetate, betamethasone, prednisolone and triamcinolone were about 0.25 g/ml; 0.36 g/ml; 0.30 g/ml và 0.33 g/ml, respectively. The calibration curve of each glucocorticoid had a correlation coefficient close to 1. The precisions were all less than 3%. The recovery rates of extraction were 93 - 99% for all glucocorticoids. This method can be used to detemine dexamethasone acetate, betamethasone, prednisolone and triamcinolone simultaneously in cosmetics. * Key words: HPLC; Glucocorticoid; Dexamethasone acetate; Betamethasone; Prednisolone; Triamcinolone; Cosmetics. * Häc viÖn Qu©n y ** Trung t©m KiÓm nghiÖm Hµ Néi Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daodonvan@yahoo.com) Ngày nhận bài: 8/5/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/6/2013 Ngày bài báo được đăng: 20/6/2013 1
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 ĐẶT VẤN ĐỀ - Mẫu thử: là mẫu tự tạo có thành phần giống như mẫu trắng, đồng thời đã được Trong xã hội hiện đại, nhu cầu sử dụng trộn GC với hàm lượng 0,05% từng chất. mỹ phẩm ngày càng nhiều nhưng hiệu quả * Dung môi, hoá chất: và độ an toàn của mỹ phẩm là vấn đề đáng quan tâm với ngành dược mỹ phẩm. Một số - Chất chuẩn: DA, BE, PR và TR do Viện doanh nghiệp bất chấp sự an toàn của người Kiểm nghiệm Thuốc TW cung cấp. tiêu dùng, đã trộn một số thuốc vào trong - Methanol, acetonitril (Merck) đạt tiêu các mỹ phẩm, đặc biệt là glucocorticoid (GC). chuẩn HPLC. Trong đó, DA, BE, PR và TR là những GC - Các hoá chất, dung môi khác: ethanol, rẻ tiền, dễ kiếm và thường được sử dụng methanol đạt tiêu chuẩn phân tích. để trộn trong mỹ phẩm [2, 3, 4]. GC là thuốc * Thiết bị và dụng cụ phân tích: có tác dụng chống viêm mạnh, chống dị ứng, ức chế miễn dịch và là thuốc phải bán Các thiết bị phân tích đều được chuẩn theo đơn. Các mỹ phẩm trộn lẫn GC có hóa theo ISO/IEC 17025 (2005) bao gồm: nhiều tác dụng không mong muốn như: teo - Thiết bị phân tích: hệ thống HPLC da, xơ cứng bì, viêm da đỏ ửng, giãn mao Alliance Waters 2695D, 4 kênh dung môi, mạch, mụn trứng cá hoặc bội nhiễm nấm, vi bơm mẫu tự động, có buồng gia nhiệt cột, khuẩn, virut Xuất phát từ những vấn đề detector PDA, cột sắc ký Gemini C18 (250 x trên, năm 2003, Hiệp định Hòa hợp ASEAN 4,6 mm, 5 µm)... Phần mềm xử lý số liệu về quản lý mỹ phẩm đã có quy định cấm Empower® 2. trộn GC vào trong mỹ phẩm [1]. Ở nước ta, - Thiết bị dụng cụ khác: cân phân tích những nghiên cứu về định lượng đồng thời Sartorius độ chính xác 0,1 mg, máy lắc siêu nhiều GC trong mỹ phẩm còn hạn chế. âm, các dụng cụ thủy tinh, bình định mức, Thực tế, đòi hỏi cần có một quy trình phân pipet có độ chính xác thích hợp. tích đồng thời nhiều GC trong mỹ phẩm. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. mục tiêu: Xây dựng được quy trình định lượng * Khảo sát quy trình định lượng: đồng thời DA, BE, PR và TR trong mỹ phẩm Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu [2, 3, bằng HPLC, góp phần đảm bảo chất lượng 4], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý mẫu mỹ phẩm lưu hành trên thị trường. như sau: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Cân chính xác 2,0 gam mẫu thử vào cốc NGHIÊN CỨU mỏ 100 ml. Thêm 20 ml MeOH vào cốc, lắc siêu âm trong 10 phút ở 400C. Ngâm trong 1. Nguyên vật liệu nghiên cứu. nước đá 30 phút. Lọc dịch chiết qua giấy * Đối tượng nghiên cứu: lọc đã thấm ẩm MeOH vào bình định mức - Mẫu trắng: là mẫu tự tạo được bào chế 100 ml. Thêm tiếp 20 ml MeOH vào trong dưới dạng kem dầu trong nước (D/N), là cốc mỏ, tiến hành chiết như trên (làm 2 lần), dạng bào chế thường gặp với các mỹ phẩm gộp dịch chiết vào bình định mức; tráng cốc làm trắng da trên thị trường. Thành phần và giấy lọc bằng 10 ml MeOH (làm 3 lần) rồi gồm: alcol cetylic, avÝt stearic, dầu parafin, chuyển vào bình định mức. Sau đó, thêm span 80, tween 80, ethanol 96%, propylen MeOH đến vạch, lắc đều. Lọc lạnh qua màng glycol, alcol paraben, nước cất. lọc 0,45 µm để phân tích HPLC. * Điều kiện sắc ký [2, 3, 4] : 2
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 Sau khi tham khảo các tài liệu, chúng tôi (45/55) (v/v); hệ pha động 2 (ACN:H2O) với lựa chọn được điều kiện như sau: tỷ lệ 30/70, 45/55 và 60/40 (v/v). Cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), * Thẩm định quy trình định lượng: detector UV-Vis đo ở bước sóng 240 nm, Thẩm định quy trình định lượng với các Thể tích bơm mẫu 50 µl, tốc độ dòng ch ỉ tiêu: tính tương thích của hệ thống sắc 1,0 ml/phút. Tiến hành khảo sát 2 hệ pha ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng độ động: hệ pha động 1 MeOH:H2O với tỷ lệ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Khảo sát quy trình định lƣợng. Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo sát điều kiện sắc ký theo quy trình định lượng ghi sắc ký đồ (hình 1). Phân tích kết quả, đã lựa chọn được điều kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời 4 chất DA, BE, PR và TR như sau: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm); detector UV - Vis; pha động ACN:H2O (45:55, v/v); tốc độ dòng 1,0 ml/phút; thể tích bơm mẫu 50 µl. 0.04 AU 0.02 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 Minutes Hình 1: Sắc ký đồ của DA, BE, TR và PR với pha động ACN:H2O là 45/55 (v/v). 2. Thẩm định quy trình định lƣợng. * Tính tương thích hệ thống sắc ký: Tiêm sắc ký 6 lần mẫu chuẩn hỗn hợp gồm chất DA, BE, PR và TR có cùng nồng độ là 10 µg/ml. Chạy sắc ký theo điều kiện đã chọn. Bảng 1: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký. PR BE TR DA STT tR Spic tR Spic tR Spic tR Spic (phút) (μV.s) (phút) (μV.s) (phút) (μV.s) (phút) (μV.s) 1 4,647 314.768 6,058 261.884 7,157 223.465 12,931 249712 2 4,651 318.520 6,069 258.638 7,210 228.490 12,945 256374 3 4,640 309.783 6,063 262.578 7,148 218.861 13,027 249458 3
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) 4 4,650 307.681 6,110 259.004 7,153 221.276 12,935 253781 5 4,693 318.205 6,066 266.254 7,167 217.753 13,025 250485 6 4,655 314.571 6,092 269.578 7,208 221.250 12,942 259381 X 4,656 313.921,3 6,076 262.989,3 7,174 221.849,2 12,968 253.198,5 SD 0,017 4.014,64 0,018 3.878,93 0,026 3.490,63 0,042 3.700,37 RSD (%) 0,37 1,28 0,30 1,47 0,36 1,57 0,32 1,46 Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic cả 4 chất đều < 2%, chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, có thể ứng dụng để phân tích mẫu với kết quả tin cậy. * Độ chọn lọc - đặc hiệu: Tiến hành phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp của PR, BE, TR và DA có nồng độ 1 µg/ml, mẫu trắng và mẫu thử. 0.010 BE PR TR a 0.005 DA 0.000 AU -0.005 -0.010 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 Minutes 0.010 0.008 b 0.006 AU 0.004 0.002 0.000 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 Minutes 0.010 TR c BE 0.005 PR DA AU 0.000 -0.005 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 Minutes Hình 2: Sắc ký đồ của PR, BE, TR và DA trong mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng. (a. Mẫu chuẩn hỗn hợp PR, BE, TR và DA pha trong MeOH; b. Mẫu trắng không có chất phân tích; c. Mẫu thử có chất phân tích). 4
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 Trên sắc ký đồ mẫu trắng, tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của PR, BE, TR và DA không xuất hiện các pic như ở mẫu chuẩn. Các pic của chất phân tích trong mẫu thử cân đối và tách hoàn toàn khỏi pic tạp. Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt và độ đặc hiệu cao. * Khoảng tuyến tính: Pha một dãy dung dịch chuẩn PR, BE, TR và DA nồng độ khoảng 1 - 50 µg/ml, tiến hành sắc ký. Bảng 2: Kết quả xác định mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của PR, BE, TR và DA. LOẠI DUNG DỊCH 1 2 3 4 5 6 GC Nồng độ (µg/ml) 1,04 2,08 5,20 10,40 20,80 52,00 Diện tích pic 27.135 59.340 155.850 305.741 598.679 151.4761 PR (μV.s) Phương trình hồi quy: y = 30274x - 401 Hệ số tương quan: R² = 0,9999 Nồng độ (µg/ml) 1,02 2,04 5,1 10,2 20,4 51,00 Diện tích pic 24.188 52.139 124.989 263.733 515.347 1.286.017 BE (μV.s) Phương trình hồi quy: y = 25733x + 322 Hệ số tương quan: R² = 0,9999 Nồng độ (µg/ml) 1,00 2,00 5,00 10,00 20,00 50,00 Diện tích pic 22.397 47.102 103.730 232.912 452.023 1.131.057 TR (μV.s) Phương trình hồi quy: y = 22642x - 550 Hệ số tương quan: R² = 0,9998 Nồng độ (µg/ml) 0,96 1,92 4,80 9,60 19,20 48,00 Diện tích pic 24.621 46.506 126.078 259.029 520.997 1.280.242 DA (μV.s) Phương trình hồi quy: y = 25677x - 350 Hệ số tương quan: R² = 0,9999 5
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 X Hình 3: Đường biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của PR, BE, TR, DA. Diện tích pic và nồng độ PR, BE, TR và DA trong khoảng khảo sát có tương quan chặt chẽ với R2 ≈ 1. * Độ lặp lại: Cân chính xác 2 g mẫu thử (với 6 lần cân khác nhau) và xử lý theo quy trình xử lý mẫu. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn. Bảng 3: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp HPLC. HÀM LƯỢNG CỦA TỪNG GC TÌM THẤY TRONG MẪU TỰ TẠO (mg/100 g) STT PR BE TR DA b 1 48,72 48,93 48,23 47,92 2 47,53 48,52 46,56 47,03 3 47,12 46,91 47,91 48,26 4 47,23 48,52 45,24 49,35 5 46,89 47,28 46,08 47,79 6 45,57 46,65 48,02 46,34 47,18 47,80 47,01 47,78 SD 1,02 0,97 1,23 1,03 RSD (%) 2,16 2,03 2,62 2,16 Độ lệch chuẩn tương đối đều < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt, đáp ứng yêu cầu phân tích. * Độ đúng: Cân chính xác 2 g mẫu thử (6 lần cân khác nhau). Thêm một lượng chính xác chất chuẩn hỗn hợp PA, BE, TR và DA (200 µg), trộn đều, tiến hành xử lý mẫu và phân tích sắc ký theo điều kiện đã chọn. 6
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 Bảng 4: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC. LOẠI LƯỢNG THẤM LƯỢNG TÌM LẠI CỦA GC TỶ LỆ TÌM TÍNH TOÁN THỐNG KÊ CHẤT VÀO (µg) CHUẨN THẤM VÀO (µg) LẠI (%) 208 204,68 98 208 199,32 96 X (%) = 95,83 208 201,25 97 PR SD = 1,94 208 195,05 94 RSD (%) = 2,02 208 202,12 97 208 194,47 93 204 201,08 99 204 200,01 98 = 96,83 204 194,54 95 (%) BE SD = 2,14 204 195,67 96 RSD (%) = 2,21 204 202,55 99 204 190,81 94 200 198,34 99 200 186,56 93 (%) = 96,71 200 195,78 98 TR SD = 2,42 200 191,23 96 RSD (%) = 2,50 200 195,57 98 200 188,89 94 192 190,45 99 192 178,96 93 (%) = 96,17 192 185,67 97 DA SD = 2,23 192 180,45 94 RSD (%) = 2,32 192 185,56 97 192 186,43 97 Tỷ lệ thu hồi của PR, BE, TR và DA khá cao (từ 95,83 - 96,83%) cho thấy: phương pháp chiết đã lựa chọn cho phép chiết gần như hoàn toàn PR, BE, TR và DA với giá trị RSD < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao. * Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới: Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn, ngoại suy giới hạn định lượng dưới của PR, BE, TR và DA lần lượt là 0,30 µg/ml; 0,36 µg/ml; 0,33 µg/ml và 0,25 µg/ml. Giới hạn phát hiện của PR, BE, TR và DA tương ứng là 0,09 µg/ml; 0,11 µg/ml; 0,10 µg/ml và 0,08 µg/ml. 7
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình 1. Hiệp định về hệ thống hoà hợp trong quản lý mỹ phẩm (Agreement on the ASEAN harmonized định lượng đồng thời PR, BE, TR và DA Cosmetic Regulatory Scheme) ký ngày 2-9-2003. bằng phương pháp HPLC. Quy trình xử lý 2. Asean. Identification of dexamethasone, mẫu: chiết bằng MeOH (3 lần), lọc qua betamethasone, hydrocortisone acetate, màng lọc 0,45 µm để phân tích bằng HPLC. betamethasone 17-valerate, and triamcinolone Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini C18 acetonide in cosmetic products by TLC and HPLC, ACM MAL 07. (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV, pha 3. Nam Y S, I K Kwon et al. Quantitative động ACN:H2O (45:55, v/v), tốc độ dòng 1,0 monitoring of corticosteroids in cosmetic products ml/phút, thể tích bơm mẫu 50 µl. Quy trình manufactured in Korea using LC-MS/MS. Forensic định lượng này đã được thẩm định đầy đủ Scient. 2012, 220 (1-3), pp.23-28. theo hướng dẫn của ICH và có thể ứng 4. Wu Da-nan, Zheng He-Hui, Wang Ping, Li Jie. Determination of 8 glucocorticoids in cosmetics by dụng để kiểm tra GC trong mỹ phẩm trên ultra performance liquid chromatography. Chinese thị trường. journal of health laboratory technology. 2008. 8
9. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 9