Định lượng acid amin tự do trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng

Nội dung text: Định lượng acid amin tự do trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng

1. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO TRONG DỊCH SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG Lê Duy Cường1, Trần Thị Chi Mai2 1Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec, 2Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu này nhằm thẩm định quy trình kỹ thuật cải tiến định lượng acid amin tự do trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC). Các acid amin trong mẫu thử được dẫn xuất bằng AQC (6 - aminoquinolyl - N - hydroxysuccinimidyl carbamate) để chuyển thành các chất có thể phát hiện được bằng đầu dò cực tím (UV), phân tách các dẫn xuất AQC của acid amin bằng phương pháp UPLC, định lượng bằng đầu dò TUV. Giới hạn định lượng của phương pháp là 5 µmol/L. Khoảng tuyến tính của phương pháp là từ 5 đến 1000 µmol/L. Độ chính xác ngắn hạn CV ≤ 2,4%, độ chính xác dài hạn CV ≤ 3%. Qui trình kỹ thuật cải tiến định lượng acid amin tự do trong dịch sinh học bằng phương pháp UPLC chính xác và xác thực, có thể sử dụng để phục vụ chẩn đoán và theo dõi điều trị các rối loạn chuyển hoá bẩm sinh. Từ khoá: acid amin, dịch sinh học, sắc ký lỏng siêu hiệu năng, rối loạn chuyển hoá bẩm sinh I. ĐẶT VẤN ĐỀ Định lượng acid amin tự do trong máu và thần kinh, bệnh tim mạch, kháng insulin, nước tiểu là một công cụ quan trọng trong nghiên cứu sinh lý, dược lý, nuôi cấy tế bào chẩn đoán và theo dõi các rối loạn chuyển hóa và phân tích giá trị dinh dưỡng ở thực phẩm bẩm sinh. Sử dụng phân tích acid amin tự do [3; 4; 5]. trong chương trình sàng lọc sơ sinh đã cho Theo các báo cáo từ Khoa Nội tiết và Rối phép chẩn đoán nhanh một số rối loạn chuyển loạn chuyển hóa Bệnh viện Nhi Trung ương hóa bẩm sinh như bệnh phenylceton niệu, trong vài năm gần đây, số trẻ mắc các bệnh MSUD (maple syrup urine disease), một số rối rối loạn chuyển hóa bẩm sinh với tỷ lệ 1/5000 loạn trong chu trình urê, bệnh homocystine trẻ sinh ra, trong đó tỷ lệ tử vong lên đến niệu [1; 2]. Việc theo dõi cẩn thận và duy trì 48%. Đồng thời việc xét nghiệm chẩn đoán nồng độ acid amin trong máu ở mức tối ưu ở rất khó khăn, các mẫu bệnh phẩm định lượng những bệnh nhân này sẽ mang lại những lợi acid amin tự do phải gửi ra nước ngoài dẫn ích lâu dài trong điều trị. Bên cạnh ứng dụng đến kết quả xét nghiệm rất chậm. Ở Việt trong đánh giá tình trạng dinh dưỡng ở bệnh Nam, có nhiều bệnh nhân mắc rối loạn nhân mắc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh, định chuyển hóa bẩm sinh nhưng không được lượng acid amin tự do trong các dịch sinh vật chẩn đoán xác định sớm đã dẫn đến những khác còn được áp dụng trong một số nghiên di chứng nặng nề [1]. Trên Thế giới, định cứu như: tình trạng suy tế bào gan, bệnh lý lượng acid amin tự do trong máu và nước ung thư, chuyển hóa cơ, rối loạn dẫn truyền tiểu đã được tiến hành từ những năm đầu thập niên 60 của thế kỷ XX [6; 7]. Phương Địa chỉ liên hệ: Lê Duy Cường, Bệnh viện Đa khoa Quốc pháp phổ biến nhất được sử dụng là sắc ký tế Vinmec trao đổi ion với dẫn xuất hậu cột bằng Email: v.cuongdl@vinmec.com Ngày nhận: 25/7/2016 ninhydrin. Đây là phương pháp có ưu điểm rẻ Ngày được chấp thuận: 18/12/2016 tiền, dễ sử dụng. Tuy nhiên, sắc ký trao đổi 62 TCNCYH 102 (4) - 2016
2. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ion có nhược điểm là thời gian phân tích dài Mẫu thử được khử protein bằng dung dịch (120 phút/mẫu) và đòi hỏi về bảo trì phức tạp acid sulfosalicylic (SSA) 10% chứa nội chuẩn nên kỹ thuật này trở nên không phù hợp với norvaline 250 µM với thể tích tương đương, ly các phòng xét nghiệm [2,8,9] tâm dung dịch trong thời gian 5 phút ở tốc độ Trong những năm gần đây, một phương 13000 vòng/phút, thu dịch nổi và tiến hành tạo pháp mới đã được ứng dụng để thay thế cho dẫn xuất theo quy trình của nhà sản xuất. phương pháp sắc ký trao đổi ion: sắc ký lỏng Phương pháp phân tích acid amin bao siêu hiệu năng (Ultraperformance liquid gồm các giai đoạn sau: chromatography - UPLC). So với sắc ký trao (1) Kiềm hoá mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu đổi ion, phương pháp UPLC có ưu thế vượt trắng (blank) đã được khử tạp bởi SSA bằng trội ở hiệu năng và rút ngắn được thời gian dung dịch NaOH/ borat. phân tích [8; 9; 10]. Khoa Hóa sinh, Bệnh viện Nhi Trung ương đã được trang bị hệ thống (2) Phản ứng tạo dẫn xuất: Dẫn xuất hoá UPLC nhằm phân tích acid amin tự do trong các acid amin trong mẫu thử bằng AQC (6 - các dịch sinh vật, phục vụ cho việc chẩn đoán, aminoquinolyl - N - hydroxysuccinimidyl sàng lọc, theo dõi điều trị một số rối loạn carbamate) để chuyển các acid amin bậc một và bậc hai thành các chất có thể phát hiện chuyển hóa bẩm sinh. Để có thể áp dụng thiết được bằng đầu dò cực tím (UV). bị UPLC vào phân tích acid amin tự do, cần phải đánh giá phương pháp trước khi đưa vào (3) Phân tách các dẫn xuất AQC của acid sử dụng. Do đó, đề tài được tiến hành với amin bằng phương pháp UPLC, định lượng mục tiêu: Thẩm định quy trình định lượng acid bằng đầu dò TUV. amin tự do trong máu và nước tiểu bằng 3. Thẩm định phương pháp định lượng phương pháp UPLC. acid amin tự do trong dịch sinh học bằng II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP UPLC - Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp: 1. Trang thiết bị và chất liệu nghiên cứu Nước cất tinh khiết và chuẩn nồng độ cao Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng gần với giá trị trên dự đoán của khoảng phân (UPLC) Acquity của Waters; Cột sắc ký tích. Trộn hai mẫu chuẩn trên với các tỷ lệ thể MassTrak AAA Column, 1,7 µm 150 x 2,1 mm; tích như sau: 1/0, 4/1, 3/2, 2/3, 1/4 và 0/1. Chuẩn acid amin của Sigma-Aldrich; Thuốc Tiến hành phân tích định lượng các acid amin thử MassTrak AAA tạo dẫn xuất acid amin của trong 6 mẫu trên. Mỗi mẫu làm lặp lại 03 lần. Waters. Pha động A: MassTrak AAA Eluent A Tính giá trị trung bình thu được của mỗi mẫu. Concentrate, pha loãng 1:10 (8 - 10% Vẽ đồ thị để đánh giá độ tuyến tính bằng phần acetonitrile, 4 - 6% formic acid, 84 - 88% mềm được tích hợp trong hệ thống UPLC với: ammonium acetate/H O). Pha động B: 2 trục hoành X là nồng độ pha loãng (0%, 20%, MassTrak AAA Eluent B đậm đặc (≥ 95% 40%, 60%, 80%, 100%), trục tung Y là nồng acetonitrile, ≤ 5% acetic acid). độ trung bình đo được mỗi nồng độ qua 3 lần. 2. Kỹ thuật định lượng acid amin bằng Thiết lập phương trình Y = aX + b. Tính hệ số 2 UPLC tương quan R, nếu R ≥ 0,99 thì chấp nhận TCNCYH 102 (4) - 2016 63
3. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC dải giá trị này, nếu không đạt thì phải thu hẹp bình thường được phân tích trong một lần dải nồng độ cho đến khi đạt được R2 ≥ 0,99. chạy, đo lặp lại 10 lần (n = 10), thu thập dữ - Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ) liệu và đánh giá độ chính ngắn hạn. LOQ được xác định bằng phân tích các + Xác định độ chính xác dài hạn (độ tái dung dịch acid amin chuẩn ở các mức độ lặp): mẫu QC được chạy trong 20 mẻ khác khác nhau trong một lần chạy. Pha loãng dung nhau (n = 20) trong vòng 3 tháng, trong mỗi dịch chuẩn có nồng độ cao nhất để thu được mẻ, mẫu QC được đo lặp lại 3 lần, thu thập các dung dịch có tỷ lệ pha loãng 2, 4, 8, 16, dữ liệu và đánh giá độ chính xác dài hạn. 32, 64 lần. Các chuẩn pha loãng được chạy + Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn lặp lại 3 lần trong một mẻ phân tích. Tính SD (SD) và hệ số biến thiên (CV) để đánh giá và CV, LOQ là giá trị nồng độ thấp nhất mà tại độ chính xác ngắn hạn và dài hạn. Tiêu đó phương pháp vẫn còn tuyến tính chặt chẽ chuẩn chấp nhận: theo AOAC, độ chính chấp với R > 0,99, CV ≤ 20%. -6 -4 nhận được khi phân tích nồng độ 10 - 10 - Độ chính xác của phương pháp mol/L là CV < 11% đối với độ chính xác dài + Xác định độ chính xác ngắn hạn (độ lặp hạn, và CV < 5,3% đối với độ chính xác ngắn lại): mẫu QC được tạo từ huyết tương của trẻ hạn. [3] III. KẾT QUẢ Hình 1. Kết quả phân tích ở nhiệt độ 430 C Ở nhiệt độ được khuyến cáo bởi Waters trong quy trình chuẩn, hiệu năng phân tách kém ở các cặp His + PEA, EA + Asp, Lys + Tyr, Arg + Gly. Các cặp His + PEA và Lys + Tyr bị lẫn vào nhau. Hình 2. Kết quả phân tích ở nhiệt độ 41,20 C 64 TCNCYH 102 (4) - 2016
4. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Có sự cải thiện rõ ở tất cả các cặp peak khó phân tách: His + PEA, Arg + Gly, EA + Asp, Lys + Tyr. Hình 3. Sự cải thiện hiệu năng phân tách khi thay đổi gradient pha động Khảo sát ở nhiệt độ 41,20 C, chúng tôi đã thu được sự cải thiện rõ rệt tại các thời gian lưu xuất hiện các cặp peak khó phân tách: His/PEA, Arg/Gly, EA/Asp, Lys/Tyr. Bảng 1. So sánh gradient của hai phương pháp Gradient tiêu chuẩn (Waters) Gradient cải tiến Thời gian (phút) mL/phút %A %B Curve Thời gian (phút) %A %B Curve 4,5 0,400 98,5 1,5 6 4,5 98,1 1,9 6 7,0 0,400 98,0 2,0 6 7,0 97,5 2,5 5 8,0 0,400 98,0 2,0 6 8,0 97,9 2,1 5 20,0 0,400 88,0 12,0 6 20,0 87,0 13,0 6 21,0 0,400 88,0 12,0 6 21,0 88,0 12,0 6 Thay đổi tỷ lệ % A/B có ý nghĩa trong việc thay đổi nhẹ mức pH tại mỗi thời điểm mong muốn, tại phút 4,5 (His + PEA), 7 (Arg), 8 (Gly) và 20 (Lys + Tyr) giảm % A và tăng % B làm tăng nhẹ pH của hỗn hợp pha di động. Phút 21 đặt lại tỷ lệ ban đầu nhằm thiết lập pH như trong trong phương pháp tiêu chuẩn. Kết quả được cải thiện sau khi thay đổi tỷ lệ % giữa A và B. Bảng 2. Khảo sát độ tuyến tính trong khoảng 5 - 1000 µmol/L TT Acid amin R R2 TT Acid amin R R2 1 Ala 0,999810 0,999620 14 Thr 0,999972 0,999944 2 His 0,998439 0,996881 15 Cyst 0,999885 0,999769 3 PEA 0,987842 0,975832 16 Phe 0,999079 0,998160 4 Asn 0,999897 0,999793 17 Orn 0,999777 0,999554 5 Ser 0,999508 0,999016 18 Lys 0,999516 0,999032 TCNCYH 102 (4) - 2016 65
5. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TT Acid amin R R2 TT Acid amin R R2 6 Gln 0,999973 0,999947 19 Tyr 0,999225 0,998451 7 Carn 0,999709 0,999418 20 Tryp 0,998685 0,997372 8 Arg 0,999697 0,999394 21 Met 0,999664 0,999329 9 Gly 0,999800 0,999600 22 Val 0,999994 0,999988 10 EA 0,999218 0,999177 23 Ile 0,999983 0,999966 11 Asp 0,997961 0,995925 24 allo 0,999948 0,999896 12 Glu 0,998928 0,997858 25 Leu 0,999968 0,999936 13 Cit 0,999953 0,999907 26 HCys 0,999813 0,999627 Tất cả các acid amin điển hình đều có hệ số tương quan R > 0,99 trong khoảng nồng độ 5 - 1000 µmol/L. Giới hạn định lượng (LOQ): Trong nghiên cứu này, LOQ của các acid amin là 5 µmol/L. Bảng 3. Minh hoạ giới hạn định lượng của Valine 66 TCNCYH 102 (4) - 2016
6. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC (STD5, STD10 các mức nồng độ 5, 10 µmol/L. % Deviation: phần trăm độ lệch. Trong giới hạn từ 5 - 1000 µmol/L, R và R2 của valine đều thỏa mãn đều thỏa mãn điều kiện > 0,99, đồng thời độ lệch ≤ 8,15%. Nồng độ khảo sát càng ở mức thấp thì độ lệch càng tăng. Bảng 4. Độ chính xác dài hạn (độ lặp lại) Acid Ala His PEA Asn Ser Gln Carn Arg Gly EA Asp Glu Cit Thr amin Mean 216,0 210,5 217,0 220,1 221,9 222,1 223,2 221,8 216,6 215,4 216,9 215,8 221,3 221,6 (µmol/L) SD 2,71 2,13 5,49 3,19 3,19 2,99 3,67 4,16 2,20 3,07 3,01 2,92 2,84 2,80 (µmol/L) CV (%) 1,3 1,0 2,5 1,5 1,4 1,3 1,6 1,9 1,0 1,4 1,4 1,4 1,3 1,3 Acid Cyst Phe Orn Lys Tyr Tryp Met Val lle Allo Leu HCys amin Mean 226, 220, 218, 214, 219, 221, 219, 217, 229,8 222,0 218,7 225,3 (µmol/L) 7 8 9 5 9 0 7 9 SD 3,36 3,10 3,64 3,66 4,63 3,55 5,02 2,81 3,31 2,93 2,76 4,03 (µmol/L) CV (%) 1,5 1,4 1,7 1,7 2,0 1,6 2,3 1,3 1,5 1,3 1,3 1,8 Độ chính xác dài hạn của tất cả các acid amin đều có CV < 3,0%. Bảng 5. Độ chính xác ngắn hạn (độ lặp lại) Acid Ala PEA Asn Ser Gln Carn Gly EA Asp Glu Cit Thr amin Mean 344,2 265,6 56,1 124,6 371,39 8,6 182,9 10,8 12,8 193,3 24,8 98,8 (µmol/L) SD 0,08 0,09 0,06 0,07 0,12 0,07 0,51 0,07 0,03 0,06 0,01 0,01 CV (%) 0,02 0,04 0,122 0,06 0,03 0,87 0,28 0,69 0,20 0,03 0,05 0,01 Acid amin Cyst Phe Orn Lys Tyr Met Val lle Leu Tryp Mean (µmol/L) 6,8 48,6 68,5 188,4 52,2 18,2 208,3 71,3 113,4 41,3 SD 0,04 0,03 0,04 0,15 0,01 0,06 0,02 0,39 0,13 0,37 CV (%) 0,67 0,13 0,07 0,08 0,22 0,36 0,01 0,55 0,11 0,91 Độ chính xác ngắn hạn của các acid amin < 1%. TCNCYH 102 (4) - 2016 67
7. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC IV. BÀN LUẬN 5), Arg/Gly(phút 7 - 7,5), EA/Asp (phút 7,5 - 8,0), Lys/Tyr (phút 19 - 21). Dựa theo điểm Khi áp dụng phương pháp UPLC tiêu đẳng điện (pI- isoelectric point) của từng acid chuẩn của hãng Waters vào điều kiện thực tế, amin: His (7,59), Arg (10,76), Gly (5,97), Lys một số các cặp peak bị chồng như His/PEA (9,74), Tyr (5,66) [5], chúng tôi đã thay đổi tỷ (phút 4,4 - 5), Arg/Gly (phút 7 - 7,5), EA/Asp lệ % dung dịch A và B tại các thời gian lưu (phút 7,5 - 8,0), Lys/Tyr (phút 19 - 21). Vì vậy tương ứng với từng cặp acid amin nêu trên không thể định lượng chính xác nồng độ của nhằm nâng cao hiệu năng phân tách. Tại phút các acid amin này trong mẫu phân tích. Do đó 4,5, chúng tôi giảm tỷ lệ % A/B từ 98,5/1,5 và chúng tôi đã quyết định cải tiến phương pháp 98,1/1,9 dẫn đến làm tăng nhẹ pH do acid UPLC tiêu chuẩn để nâng cao hiệu suất phân formic trong dung dịch A mạnh hơn acid ace- tách. Các thông số được khảo sát bao gồm: tic trong dung dịch B. Sự thay đổi này giúp nhiệt độ cột, tỷ lệ phần trăm của pha di động A tăng pH của hỗn hợp pha di động phù hợp với và B. Kết quả thu được cho thấy, nhiệt độ pI xu hướng kiềm của His. Kết quả thu được càng cách xa 430C thì hiệu năng phân tách là sự cải thiện hiệu quả phân tách của cặp của cặp Lys/Tyr càng tăng. Càng giảm nhiệt His/PEA. Tại phút thứ 7, tỷ lệ % A/B từ 98/2 độ thì hiệu năng phân tách của cặp EA/Asp và 97,5/2,5, gây tăng nhẹ pH phù hợp với pI càng tăng, trong khi hiệu năng phân tách của 10,76 của Arg, và kết quả thu được là cải cặp Arg/Gly càng giảm. Cặp His/PEA là trở thiện đáng kể khả năng phân tách cặp Arg/ ngại lớn nhất trong quá trình khảo sát do dù Gly. Tại phút 8, pI của Asp nằm trong vùng pH tăng hay giảm nhiệt độ đều phân tách được thấp nên chúng tôi đã khôi phục lại tỷ lệ % so với ở 430C nhưng hiệu năng phân tách là A/ B gần giống với tỷ lệ chuẩn ban đầu của không cao, chưa thể phân tách hoàn toàn. phương pháp Waters tiêu chuẩn - nhằm hạ Những khó khăn này cũng được công bố khi nhẹ pH. Kết quả là chúng tôi đã thành công tiến hành nghiên cứu trên mẫu huyết tương trong phân tách cặp EA/Asp. Tại phút 20, pI [4]. Tuy nhiên, ở nghiên cứu khác thì hiệu của Lys nằm trong vùng pH kiềm, nên chúng năng phân tách là tối ưu khi tiến hành phương tôi đã nâng pH của dung dịch rửa giải bằng pháp UPLC tiêu chuẩn (430C) [2]. Điều này cách thay đổi tỷ lệ % A/B từ 88/12 và 87/13, cho thấy, không phải cùng một phương pháp tại phút 21, pI của tyrosin nằm trong vùng pH tiêu chuẩn của nhà sản xuất khi áp dụng ở acid nên chúng tôi đã khôi phục lại tỷ lệ % A/B những phòng xét nghiệm khác nhau thì cùng ban đầu: 88/12. Sự thay đổi này đã cải thiện cho ra một kết quả tối ưu giống nhau, đặc biệt rõ ràng hiệu năng phân tách của cặp Lys/Tyr. là với phương pháp sắc ký. Kết quả khảo sát cho thấy ở 41,20C, hiệu năng phân tách là tối Trong nghiên cứu về acid amin đã được ưu nhất. Nhiệt độ này cũng gần giống với công bố, gradient được giữ nguyên như ở gra- nhiệt độ 410C trong một nghiên cứu khác [4]. dient tiêu chuẩn của Waters, nhưng pH được Sau khi thu được nhiệt độ tối ưu, chúng tôi thay đổi trong toàn bộ quá trình phân tách do tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ % của dung dịch B được thay đổi từ acid acetic thành pha động A và B lên hiệu năng phân tách. acid formic và kết quả thu được là sự cải thiện Khảo sát này sẽ tập trung tại các cặp peak có hiệu năng tách của cặp Lys/ Tyr và làm giảm hiệu năng phân tách thấp: His/PEA (phút 4,4 - độ lệch qua các lần chạy lặp lại [4]. 68 TCNCYH 102 (4) - 2016
8. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Sau khi thay đổi phương pháp so với độ tuyến tính khi sử dụng phương pháp UPLC phương pháp tiêu chuẩn, các thực nghiệm - MS/MS là rất cao [6]. đánh giá được tiến hành bao gồm: khoảng Trong nghiên cứu của chúng tôi, giới hạn tuyến tính, giới hạn định lượng, độ chính xác. định lượng (LOQ) là 5 µmol/L, LOQ ở các Trong dải 1 - 1000 µmol/L chúng tôi chưa thu nghiên cứu được công bố trước đây đều bằng được hệ số R2 > 0,99 ở tất cả các acid amin 2 µmol/L [2; 4], so với các nghiên cứu này thì như mong muốn. Tiến hành thu hẹp dải phân LOQ trong nghiên cứu này cao hơn. Nồng độ tích về 5 - 1000 µmol/L, chúng tôi đã thu được acid amin máu và nước tiểu trong dải tuyến hệ số R2 > 0,99 ở hầu hết các acid amin, tính của chúng tôi đã bao gồm các giá trị có ngoại trừ phosphoethanolamine (PEA) Với R2 tính quyết định lâm sàng, do đó giới hạn tuyến > 0,97- được xem là có sự tương quan tuyến tính này vẫn đảm bảo để phát hiện đúng các tính rất chặt chẽ, và với R > 0,99, được xem rối loạn chuyển hóa bẩm sinh. Độ chính xác như tiệm cận giá trị 1. Do đó có thể nói độ của phương pháp được thể hiện qua độ lệch tuyến tính trong phương pháp UPLC là rất chuẩn và hệ số biến thiên (CV). Kết quả cao, đây cũng là ưu điểm chung cho các nghiên cứu này thỏa mãn tiêu chuẩn của phương pháp sắc ký hiện đại. So sánh giá trị AOAC với CV độ chính xác ngắn hạn < 5,3% R trong nghiên cứu của chúng tôi với các tác và CV độ chính xác dài hạn < 11% ở mức -6 -4 giả khác có thể thấy rằng, trong cùng thiết kế nồng độ 10 - 10 µmol/L [3; 7]. Hệ số biến nghiên cứu định lượng acid amin bằng UPLC thiên trong nghiên cứu của chúng tôi cũng - TUV, các tác giả khác đã công bố hệ số R tương đồng với các nghiên cứu khác của các trong khoảng từ 0,8658 - 0,9932 với nhiệt độ tác giả: CV < 5% [4], CV 0,9 - 2,9% [8], CV 1,8 và gradient chuẩn [2]. Trong nghiên cứu của - 4,9% [9]) CV ≤ 6% [6], CV < 4% [10]. tác giả khác R nằm trong khoảng 0,85 - 0,99 V. KẾT LUẬN (ngoại trừ với methionine, R = 1). Trong đó, Phương pháp cải tiến định lượng acid 0,85 < R < 0,9 đối với các acid amin: Gluta- mate, proline, citrulline, valine) [4]. Hệ số R amin trong dịch sinh học bằng UPLC có: trong nghiên cứu này lớn hơn, có sự khác biệt Khoảng tuyến tính của các acid amin là này có thể do cách lấy giá trị khoảng tuyến 5 - 1000 µmol/L. Độ chính xác ngắn hạn CV < tính. Nghiên cứu này giới hạn tuyến tính là 5- 1%, độ chính xác dài hạn CV < 3%. 1000 µmol/L, trong khi nghiên cứu của các tác Lời cảm ơn giả khác là 2 - 3500 µmol/L và 2 - 2000 µmol/L [2; 4]. Khoảng tuyến tính càng rộng thì độ lệch Nhóm nghiên cứu xin bày tỏ lời cảm ơn chuẩn càng cao, điều này giải thích tại sao R sâu sắc tới Ban giám đốc Bệnh viện Nhi Trung lại càng giảm. Cùng với đó, dung dịch chuẩn ương đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực hiện với nồng độ càng thấp thì nền mẫu (matrix) nghiên cứu này. càng bị thay đổi so với dung dịch chuẩn gốc TÀI LIỆU THAM KHẢO (stock) do bị pha loãng với tỷ lệ lớn. Nghiên cứu định lượng acid amin trong dịch cơ thể 1. Hoàng Hạnh Phúc (2008). Chẩn đoán của năm (2009) với phương pháp UPLC - MS/ bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh bằng kỹ MS, R2 > 0,99 (R > 0,999) đối với tất cả các thuật sắc ký khí khối phổ. Tạp chí nghiên cứu acid amin, với LOQ là ≤ 10 µmol/L. Như vậy, y học, 57(4), 1 - 5. TCNCYH 102 (4) - 2016 69
9. TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2. Narayan S. B (2011). Measurement of 7. Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh plasma amino acids by Ultraperformance(R) Thực Phẩm Quốc Gia (2010). Thẩm định Liquid Chromatography. Clin Chem Lab Med, phương pháp trong phân tích hóa học và vi 49(7),1177 - 1185. sinh vật. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật 3. AOAC International methods commit- Hà Nội, 11 - 47. tee (2012). Guidelines for Standard Method 8. Fiechter, G. and H.K. Mayer (2011). Performance Requirements. J AOAC Int, Ap- Characterization of amino acid profiles of cul- pendix F, 9. ture media via pre-column 6-aminoquinolyl-N- 4. Peake, R.W (2013). Improved separa- hydroxysuccinimidyl carbamate derivatization tion and analysis of plasma amino acids by and ultra performance liquid chromatography. modification of the MassTrak AAA Solution J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Ultraperformance(R) liquid chromatography Sci, 879(17-18), 1353 - 1360. method. Clin Chim Acta, 423, 75 - 82. 9. Terrlink, T., P.A. van Leeuwen, and A. 5. Chauhan, B.S (2008). Principles of Bio- Houdijk (1994). Plasma amino acids deter- chemistry and Biophysics. Laxmi Publications mined by liquid chromatography within 17 min- Pvt Limited, 150 - 151. utes. Clin Chem, 40(2), 245 - 249. 6. Waterval W. A (2009). Quantitative 10. Fekkes, D (1995). Validation of the UPLC-MS/MS analysis of underivatised amino determination of amino acids in plasma by acids in body fluids is a reliable tool for the high-performance liquid chromatography using diagnosis and follow-up of patients with inborn automated pre-column derivatization with errors of metabolism. Clin Chim Acta, 407(1- o - phthaldialdehyde. J Chromatogr B Biomed 2), 36 - 42. Appl, 669(2), 177 - 186. Summarry MEASUREMENT OF AMINO ACIDS IN BIOLOGICAL SAMPLES BY ULTRAPERFORMANCE CHROMATOGRAPHY (UPLC) The aim of this study was to validate the modified method for quantitation of free amino acids by UPLC. The amino acids in samples were derivatized by AQC (6 - aminoquinolyl - N- hydroxysuccinimidyl carbamate), separated by UPLC method and quantified by TUV detector. The limit of quantitation was 5 µmol/L for all amino acids. The linearity range was 5 to 1000 µmol/L. The short - term precision was ≤ 2.4%, the long-term precision was ≤ 3%. The proposed method for quantitation of free amino acids in biological fluid using UPLC was precise and accurate. This method could be applied to the routine diagnosis and treatment monitoring of inborn error of metabolism. Key words: amino acids, physiolosical samples, UPLC, inborn error of metabolism 70 TCNCYH 102 (4) - 2016