Đánh giá và kiểm soát nhiễm adn trong sinh thiết phôi phục vụ chẩn đoán và sàng lọc tiền làm tổ

Nội dung text: Đánh giá và kiểm soát nhiễm adn trong sinh thiết phôi phục vụ chẩn đoán và sàng lọc tiền làm tổ

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM SOÁT NHIỄM ADN TRONG SINH THIẾT PHÔI PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN VÀ SÀNG LỌC TIỀN LÀM TỔ Hoàng Văn Lương*; Nguyễn Duy Bắc*; Trần Ngọc Anh* Nguyễn Thanh Tùng*; Nguyễn Văn Điều*; Nguyễn Duy Ánh** Nguyễn Thị Sim**; Phạm Đức Minh***; Đàm Linh Phương*; Đặng Tiến Trường** TÓM TẮT Mục tiêu: thiết lập kỹ thuật multiplex PCR phục vụ đánh giávà kiểm soát nhiễm trong sinh thiết phôi phục vụ sàng lọc và chẩn đoán phôi tiền làm tổ. Đối tượng và phương pháp: xây dựng phản ứng multiplex PCR trên mẫu gADN; tiến hành đánh giá trên 96 tế bào sinh thiết và 96 mẫu dung dịch rửa tương ứng. Kết quả: thiết lập được phản ứng multiplex PCR đủ mạnh; kết quả đánh giá nhiễm ADN cho thấy 13,54% số mẫu media blank bị nhiễm và 87,5% số mẫu tế bào sinh thiết phôi có chứa ADN. Kết luận: thiết lập được phản ứng multiplex PCR đủ mạnh, đánh giá trạng nhiễm ADN ngoại lai trong sinh thiết và sàng lọc trước chuyển phôi đơn giản và hiệu quả. Chất lượng quá trình sinh thiết và kiểm soát nhiễm đã được cải thiện đáng kể. * Từ khóa: Kiểm soát nhiễm; Sinh thiết phôi; Multiplex PCR. Access and Control DNA Contamination in Embryo Biopsy Procedure for Preimplantation Genetic Diagnosis/Screening Summary Objectives: To establish a multiplex PCR method for contamination and quality control of embryo biopsy in PGD/PGS. Subjects and methods: Establish multiplex PCR on gDNA; evaluation of embryo biopsy on 96 single cells along with 96 media blank samples biopsied from the same embryos. Results: Established efficiency multiplex PCR; evaluation of embryo biopsy showed that 13.54% of media blank samples were contaminated and 87.5% of total single cells samples contained DNA. Conclusion: Successfully established a simple but effective DNA contamination and quality control method by multiplex PCR in embryo biopsy and PGS. The quality of embryo biopsy procedure and DNA were approval. * Keywords: DNA contamination control; Embryo biopsy; Multiplex PCR. ĐẶT VẤN ĐỀ giá tình trạng bất thường về di truyền ở Trong chẩn đoán và sàng lọc trước cấp độ gen đến toàn bộ nhiễm sắc thể; chuyển sinh (PGD/S - Preimplantation Genetic lựa chọn các phôi không bất thường Disgnosis/Screening), các phôi được đánh trước khi chuyển vào tử cung và có thai. * Học viện Quân y ** Bệnh viện Phụ sản Hà Nội ** Trường Đại học Khoa học Công nghệ Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Đặng Tiến Trường (truongdtvmmu@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 05/09/2017 219
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 Các phôi tạo từ quy trình thụ tinh trong pháp này chưa thể khẳng định có sự xuất ống nghiệm (IVF-In vitro fertilization) được hiện ADN ngoại nhiễm hay không?. Đến sinh thiết và thu nhận một hoặc một số tế nay, các trung tâm PGD trên thế giới đều bào phôi phục vụ phân tích di truyền bằng tiến hành thử nghiệm đánh giá kết quả nhiều phương pháp, trong đó hầu hết đều sinh thiết và rửa tế bào phôi trước khi tiến có giai đoạn khuếch đại bằng phản ứng hành PGD trên lâm sàng nhằm đảm bảo chuỗi (PCR - Polemerase Chain Reaction). chất lượng kết quả chẩn đoán [4]. Ở Việt Đặc trưng của PCR trong PGD và PGS là Nam, đã có một số báo cáo về chẩn đoán cực nhạy nên rất dễ nhiễm ADN ngoại lai trước chuyển phôi nhưng chưa thấy có và khả năng mất alen (ADO - allele Dropout) nội dung nào đề cập vấn đề này. Nghiên [7, 9]... Trong đó, nhiễm ADN ngoại lairất cứu này, kỹ thuật multiplex PCR đủ nhạy khó kiểm soát dẫn đến chẩn đoán sai. được thiết lập và thực hành đánh giá quá Nguồn ADN ngoại lai rất phong phú, nhưng trình sinh thiết phôi, rửa tế bào thành chủ yếu xảy ra trong giai đoạn trước tiến công và không bị nhiễm ADN ngoại lai. hành PCR, đó là sinh thiết phôi và rửa tế VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP bào phôi [10]; ADN ngoại nhiễm có thể từ kỹ thuật viên sinh thiết phôi hoặc ADN NGHIÊN CỨU trong khu vực sinh thiết, rửa tế bào. Mẫu 1. Vật liệu nghiên cứu. media blank xuất hiện ADN cũng có thể - ADN tổng số của đối tượng nam, nữ; do quá trình sinh thiết phôi không thành mẫu tế bào phôi và mẫu dung dịch rửa công khiến tế bào bị vỡ làm thất thoát cuối cùng của mẫu tế bào phôi tương ứng. ADN vào giọt rửa. Bên cạnh đó, thành - Primer được tổng hợp bởi IDT (Mỹ) công của sinh thiết và rửa tế bào được (bảng 1); KOH (Sigma); tricine (Sigama); đánh giá bằng sinh thiết được tế bào, 2x PCR Master mix Solution i-Taq, PBS không bị vỡ; rửa tế bào đảm bảo không bị (Sigma), nước tinh khiết (Invitrogen), nhiễm ADN ngoại lai. Hiện nay, có nhiều agarose (Merk); Redsafe (Intron). phương pháp kiểm soát nhiễm: không sử dụng lại vật tư cho các lần sinh thiết phôi - Thiết bị nghiên cứu: máy PCR ProFlex tiếp theo; mặc đồ bảo hộ, rửa tế bào (Thermo Fisher Scientific, Mỹ), máy ly tâm trong tủ hút vô trùng đặt trong phòng sạch lạnh Mikro 22R (Heltich, Đức), máy điện di riêng biệt [7]; lau bề mặt thiết bị bằng khử (Cleaver Scientific, Anh), máy chụp ảnh ADN [6]; sử dụng đầu côn có cột lọc; gel OmniDOCi (Cleaver Scientific, Anh) và dùng đèn cực tím để khử nhiễm trong tủ các thiết bị khác tại Phòng Phân tích ADN, hút [1, 2, 8, 3].. Tuy nhiên, các phương Bộ môn Giải phẫu, Học viện Quân y. Bảng 1: Thông tin 2 cặp mồi trong phản ứng multiplex PCR. o Tên mồi Trình tự 5’-3’ Tm ( C) Sản phẩm FIIX-4F [5] ATGGGCTTGGACTTGGTATG 60,4 318 bp FIIX-4R [5] AGCAGCTCCTCACCAGGAT 62,3 DYS14F [11] GGGCCAATGTTGTATCCTTCTC 62,7 84 bp DYS14R [11] GCCCATCGGTCACTTACACTTC 64,5 220
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. KOH 0,6M; trung hòa bằng 1,5 µl tricine * Giai đoạn tối ưu hóa: xác định nhiệt 0,6M; nước tinh khiết tùy chỉnh để phù độ gắn mồi tối ưu của 2 cặp mồi trong hợp với thể tích phản ứng là 25 µl. phản ứng multiplex PCR trên 20 ng ADN Quá trình này gồm 4 lần đánh giá, mỗi toàn hệ gen, sau đó tiến hành phản ứng lần đánh giá trên 24 mẫu tế bào sinh thiết multiplex PCR trên 200 pg và 20 pg ADN từ phôi cùng với 24 mẫu media blank tương toàn hệ gen để xác định chu trình nhiệt ứng. Tế bào sau khi sinh thiết phôi đặt phù hợp và đánh giá khả năng thành trong 2,5 µl dung dịch PBS vào mỗi ống công của phản ứng multiplex PCR trên PCR, sau đó bổ sung 1,5 µl KOH 0,6 M, ủ mẫu tế bào sinh thiết từ phôi. 65oC trong 10 phút để ly giải tế bào và sau * Giai đoạn đánh giá quy trình sinh đó bổ sung 1,5 µl trisine 0,6 M để trung hòa. thiết phôi: tiến hành phản ứng multiplex * Địa điểm và thời gian nghiên cứu: PCR trên mẫu tế bào sinh thiết từ phôi và - Trung tâm Công nghệ Phôi, Học viện mẫu media blank tương ứng nhằm xác Quân y; Bệnh viện Phụ sản Hà Nội; Bệnh định sự xuất hiện của ADN. Thành phần viện Phụ sản Trung ương. phản ứng multiplex PCR thể tích 25 µl gồm: 1x PCR Master mix Solution; 0,5 µM - Thời gian: 12 - 2016 đến 6 - 2017. mỗi mồi trong cặp FIIX-4; 0,75 µM mỗi * Đạo đức trong nghiên cứu: mồi trong cặp DYS14, 20 pg gADN Nghiên cứu được Hội đồng Đạo đức (chứng dương) hoặc mẫu tế bào trong 2 trong nghiên cứu y sinh của Học viện µl dung dịch PBS được ly giải bằng 1,5 µl Quân y phê duyệt. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả tối ƣu hóa phản ứng multiplex PCR trên mẫu ADN. (Hình 1: Ảnh minh họa kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi DYS14 ((-): chứng âm ; 55, 60, 61, 62, 65 lần lượt là các băng sản phẩm của phản ứng ở Ta lần lượt là 55oC, 60oC, 61 oC, 62 oC, 65oC; M50, M100: Marker 50 bp, 100 bp) 221
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 Hình 2: Ảnh minh họa kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi FIIX-4 ((-): chứng âm ; 55, 60, 61, 62, 65 lần lượt là các băng sản phẩm của phản ứng ở Ta lần lượt là 55oC, 60oC, 61 oC, 62 oC, 65oC; M100: Marker, 100 bp) Để thiết lập được phản ứng PCR đủ nhạy nhằm xác định sự có mặt các đoạn ADN ngoại lai, lượng ADN tương đương của một hoặc một vài tế bào, nghiên cứu đã sử dụng cặp mồi DYS14 có 9 amplicon và Cặp mồi FIIX-4. - Xác định Ta của các primer và Ta của phản ứng multiplex PCR. Hình 1 và hình 2 cho kết quả nhiệt độ gắn mồi tối ưu của 2 cặp mồi DYS14 và FIIX- 4 đều là 60oC. Hình 3: Hình ảnh minh họa phản ứng multiplex PCR trên các mẫu ADN có nồng độ 10 pg/µl khác nhau. (F1-F5: sản phẩm các phản ứng PCR trên 20 pg ADN của nữ; M1-M5: sản phẩm các phản ứng PCR trên 20 pg ADN của nữ; (-): chứng âm; M100: marker 100 bp) 222
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi và o quả phản ứng PCR như nhiệt độ gắn mồi, thường hơn kém Tm từ 5-10 C. Căn cứ thời gian gắn mồi, thời gian kéo dài chuỗi, vào Tm (bảng 1), chúng tôi tiến hành thử hoạt động của enzym, nồng độ dNTP, nghiệm tối ưu hóa ở dải nhiệt 55 - 65oC. 2+ nồng độ Mg Khi tối ưu hóa phản ứng Sau đó, tiến hành phản ứng multiplex PCR, cần phải tối ưu hóa tất cả những PCR trên mẫu ADN có nồng độ 10 ng/µl yếu tố đó để đạt kết quả tốt nhất. Tuy và giảm dần xuống 100 pg/µl, 20 pg/µl kết nhiên, công việc này mất nhiều thời gian, hợp với điều chỉnh chu trình nhiệt phù công sức và hóa chất. Vì vậy, thực tế tối hợp cho phản ứng multiplex PCR, kết quả ưu hóa phản ứng PCR thường tiến hành thể hiện ở hình 3; ở các mẫu g ADN của lựa chọn thành phần phản ứng tiêu chuẩn nữ (F1 đến F5) xuất hiện sản phẩm có và tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi (Ta) đầu kích thước 318 bp; xuất hiện 2 băng (84 tiên. Nghiên cứu này, đã sử dụng 2x bp và 318 bp) ở các mẫu gADN của nam Master mix Solution của INtRON để tiết (M1 đến M5). kiệm thời gian và chi phí tối ưu hóa các Qua nhiều thử nghiệm khác, chúng tôi yếu tố liên quan tới thành phần phản ứng. xác định được thành phần phản ứng và Ta của phản ứng phụ thuộc vào nhiệt độ chu trình nhiệt của phẩn ứng như bảng 1. Bảng 1: Chu trình nhiệt tối ưu hóa của phản ứng multiplex PCR. Bắt đầu Biến tính Gắn mồi Kéo dài Kết thúc Bảo quản Nhiệt độ (oC) 95 95 60 72 72 11 Thời gian 15 phút 20 giây 30 giây 20 giây 3 phút +∞ Số chu kỳ 1 45 1 1 2. Kết quả thực nghiệm trên các tế bào sinh thiết từ phôi dƣ. Quá trình đánh giá gồm 4 giai đoạn khảo sát, giữa các giai đoạn có hiệu chỉnh và bổ sung các biện pháp để làm tăng tỷ lệ thu được tế bào và giảm tỷ lệ nhiễm ADN ngoại lai. Hình 3: Hình ảnh minh họa kết quả kiểm soát ADN ngoại nhiễm và đánh giá quá trình sinh thiết phôi ở lần 1. (M50: marker 50 bp; 1AN, 2AN : các mẫu media blank của các phôi số 1, 2 ; 1A, 2A: các mẫu chứa tế bào sinh thiết từ các phôi 1, 2 ; NC (negative control): đối chứng âm; PC (positive control): đối chứng dương) 223
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 Mỗi giai đoạn tiến hành thí nghiệm trên 24 mẫu tế bào sinh thiết từ phôi dư cùng 24 mẫu dung dịch rửa ở giọt rửa cuối cùng tương ứng với các phôi. Theo lý thuyết, tất cả mẫu media blank và đối chứng âm đều không có sản phẩm multiplex PCR, các mẫu chứa tế bào sinh thiết từ phôi đều xuất hiện sản phẩm của cặp mồi FIIX-4 và một số mẫu có thể có sản phẩm của cặp mồi DYS14, nếu trong hệ gen của tế bào có nhiễm sắc thể Y. Các mẫu phát hiện sản phẩm của cặp mồi DYS14 hoặc FIIX-4 hoặc cả 2 được kết luận là có chứa ADN. Hình 4: Hình ảnh minh họa kết quả kiểm soát ADN ngoại nhiễm và đánh giá quá trình sinh thiết phôi ở lần 4. (M50: marker 50 bp; 73AN, 74AN : các mẫu media blank của các phôi số 73, 74 ; 73A, 74A: các mẫu chứa tế bào sinh thiết từ các phôi 73, 74 ; NC (negative control): đối chứng âm; PC (positive control): đối chứng dương) Mẫu media blank của tế bào sinh thiết từ phôi số 2, 5 có sản phẩm của cặp mồi FIIX-4, mẫu media blank của phôi số 73, 74, 76 có sản phẩm của cặp mồi DYS14, chứng tỏ có xuất hiện ADN ngoại nhiễm. Đối chứng âm của phản ứng multiplex PCR đánh giá quá trình sinh thiết phôi âm tính, không phát hiện có sản phẩm của phản ứng multiplex PCR nên có thể loại trừ trường hợp phản ứng bị nhiễm trong quá trình làm multiplex PCR kiểm soát nhiễm. Quá trình sinh thiết phôi thành công khi trong mẫu chứa tế bào sinh thiết từ phôi phải chứa tế bào. Điều này được khẳng định khi phát hiện có sản phẩm của một hoặc cả 2 cặp mồi DYS14 và FIIX-4 trong các mẫu này. Bảng 1: Kết quả kiểm soát nhiễm ADN ngoại lai và thu được tế bào trên 96 ống chứa tế bào sinh thiết từ phôi và mẫu media blank tương ứng. Mẫu chứa tế bào Mẫu media blank 1 2 3 4 1 2 3 4 Giai đoạn (n) Tổng (96) Tổng (96) (24) (24) (24) (24) (24) (24) (24) (24) Số mẫu chứa ADN 18 20 20 22 84 5 4 2 2 13 Tỷ lệ chứa AND (%) 75,00 83,33 83,33 91,67 87,50 20,83 16,67 8,33 8,33 13,54 Trong số 96 mẫu media blank của các tế bào sinh thiết này, tổng cộng 84/96 mẫu tương ứng với tỷ lệ 87,5% số tế bào sinh thiết phôi có chứa ADN và 13/96 mẫu media 224
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 blank tương ứng với tỷ lệ 13,54% mẫu bị nhiễm ADN ngoại lai. Tuy nhiên, qua các lần khảo sát, kết quả sinh thiết phôi đã có cải thiện đáng kể: tăng tỷ lệ sinh thiết phôi thành công (lần lượt là 75%; 83,33%; 83,33%; 91,67%) và giảm số lần sinh thiết bị nhiễm ADN ngoại lai (lần lượt là 20,83%; 16,67%; 8,33%; 8,33%; 13,54%). KẾT LUẬN short tandem repeat loci on human chromosome band Xq28 for indirect Thiết lập được phản ứng multiplex haemophilia A carrier detection. Haemophilia. PCR đủ nhạy, đánh giá tình trạng nhiễm 2009, 15 (1), pp.297-308. ADN ngoại lai trong sinh thiết và sàng lọc 6. Prince A.M, Andrus L. PCR: how to kill trước chuyển phôi đơn giản và hiệu quả. unwanted DNA. Biotechniques, 1992, 12 (3), Kết quả thu tế bào và kiểm soát nhiễm pp.358-360. của quá trình sinh thiết và rửa tế bào phôi 7. Stern HJ. Preimplantation genetic được cải thiện đáng kể. diagnosis: prenatal testing for embryos finally achieving its potential. Journal of clinical TÀI LIỆU THAM KHẢO medicine. 2014, 3 (1), pp.280-309. 1. Agrawal V, Roy N. Contaminating insert 8. Tamariz J, Voynarovska K, Prinz M, degradation by preincubation colony PCR: a Caragine T. The application of ultraviolet method for avoiding false positives in irradiation to exogenous sources of DNA in transformant screening. Anal Biochem. 2008, plasticware and water for the amplification of 375 (1), pp.159-161. low copy number DNA. Journal of forensic 2. Champlot S, Berthelot C, Pruvost M, sciences. 2006, 51 (4), pp.790-794. Bennett E.A, Grange T, Geigl EM. An efficient 9. Thornhill A.R, Snow K. Molecular multistrategy DNA decontamination procedure diagnostics in preimplantation genetic of PCR reagents for hypersensitive PCR diagnosis. J Mol Diagn. 2002, 4 (1), pp.11-29. applications. PLoS One. 2010, 5 (9) 10. Thornhill A.R, Snow K. Molecular 3. Dallas-Yang Q, Jiang G, Sladek F.M. diagnostics in preimplantation genetic Avoiding false positives in colony PCR. diagnosis. The Journal of molecular Biotechniques. 1998, 24 (4), pp.580-582. diagnostics: JMD. 2002, 4 (1), 11. 4. Harper J.C, Sengupta S, Vesela K, 11. Zimmermann B, El-Sheikhah A, Thornhill A, Dequeker E, Coonen E, Morris Nicolaides K, HOLzGREVE W., Hahn S. MA. Accreditation of the PGD laboratory. Hum Optimized real-time quantitative PCR Reprod, 2010, 25 (4), pp.1051-1065. measurement of male fetal DNA in maternal 5. Machado F.B, Medina-Acosta E. High- plasma. Clinical chemistry. 2005, 51 (9), resolution combined linkage physical map of pp.1598-1604. 225