Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro và tính kích ứng da trên động vật thực nghiệm của dung dịch mafenid acetat

Nội dung text: Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro và tính kích ứng da trên động vật thực nghiệm của dung dịch mafenid acetat

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN IN VITRO VÀ TÍNH KÍCH ỨNG DA TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM CỦA DUNG DỊCH MAFENID ACETAT Lương Quang Anh*; Nguyễn Như Lâm*; Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Toàn** TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro và tính kích ứng da của dung dịch mafenid acetate (MA) trên các chủng vi khuẩn (VK) thƣờng gặp trong bỏng trên thỏ thực nghiệm. Phương pháp: sử dụng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch để đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro. 6 thỏ khỏe mạnh đƣợc đắp thuốc trên da lƣng và theo dõi điểm kích ứng da sau 72 giờ tiếp xúc. Kết quả: thuốc có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella flexneri, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Sarcina lutea. Đồng thời, thuốc cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Pseudomonas aeruginosa phân lập đƣợc tại Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia. Tuy nhiên, VK vẫn phát triển mạnh khi tiếp xúc với dung dịch MA có nồng độ < 5%. Điểm kích ứng bằng 0 khi đắp thuốc trên lƣng của thỏ thí nghiệm. Kết luận: dung dịch MA 5% có tác dụng kháng khuẩn tốt với nhiều chủng VK, trong đó có trực khuẩn mủ xanh phân lập đƣợc tại Viện Bỏng Quốc gia và không kích ứng khi sử dụng trên thỏ. * Từ khóa: Mafenid acetat; Tác dụng kháng khuẩn; Kích ứng da. Evaluation of Antibacterial Activities In Vitro and Skin Irritation of Mafenide Acetate Solution on Rabbits Summary Objectives: Evaluation of antibacterial activities in vitro and skin irritation of mafenide acetate (MA) solution on rabbits. Methods: Determination of antibacterial activities in vitro by the agar well diffusion method. Assessment of skin irritation grade on 6 healthy rabbits that were topically applied the drug on its back after 72 hours of contact. Results: The drug had effectiveness on Shigella flexneri, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Sarcina lutea. With regard to Pseudomonas aeruginosa isolated from samples obtained at Intensive Care Unit, MA solution showed its germicide similarly. Conversely, the baterium kept with its powerful growth when the drug at doses below 5% was applied on. The skin irritation grade was at zero. Conclusions: The drug showed good antimicrobial activities on some bacteria species including Pseudomonas aeruginosa isolated from our hospital. It had no skin irritation when applied on experimental rabbits. * Key words: Mafenide acetate; Antibacterial activities; Skin irritation. * Viện Bỏng Qu c gia ** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Lương Quang Anh (luongquanganh@vmmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 27/05/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 09/09/2015 Ngày bài báo được đăng: 18/09/2015 17
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 ĐẶT VẤN ĐỀ - Thuốc đối chiếu: streptomycin sulfat 16 IU/ml đối với thử kháng khuẩn VK Tại Việt Nam, nhiễm khuẩn trong bỏng Gram (-), benzathin penicillin 20 IU/ml đối đang trở thành vấn đề lớn, ảnh hƣởng với thử kháng khuẩn VK Gram (+). Môi trực tiếp đến chất lƣợng điều trị bệnh trƣờng canh thang nuôi cấy vi sinh vật nhân (BN), nhất là trong tình trạng còn gồm: NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt thiếu các thuốc kháng khuẩn tại chỗ thực 0,3%, nƣớc vừa đủ 100 ml. Môi trƣờng sự có hiệu quả. Trong đó, trực khuẩn mủ thạch thƣờng gồm: NaCl 0,5%, pepton 0,5%, xanh là VK Gram âm hàng đầu gây nhiễm cao thịt 0,3%, thạch 1,6%, nƣớc vừa đủ khuẩn bệnh viện, đặc biệt ở các BN bỏng. 100 ml. Điều trị vết thƣơng, vết bỏng nhiễm trực khuẩn mủ xanh rất khó khăn vì VK này có * Đ i tượng nghiên cứu: khả năng đề kháng cao đối với hầu hết - Chủng vi sinh vật kiểm định do Bộ các thuốc kháng sinh, đặc biệt là các môn Vi sinh - Sinh học, Đại học Dƣợc chủng đa kháng kháng sinh, làm tăng chi Hà Nội cung cấp, bao gồm: VK Gram (-): phí điều trị cũng nhƣ làm tăng tỷ lệ tử Escherichia coli (EC), Proteus mirabilis (Pro), vong ở BN bỏng [1, 2, 3]. Shigella flexneri (Shi), Salmonella typhi MA là thuốc thuộc nhóm sulfamid đã (Sal), Pseudomonas aeruginosa (Pseu). đƣợc sử dụng ở các trung tâm điều trị VK gram (+): Staphylococcus aureus (SA), bỏng trên thế giới. Đây là thuốc có độ an Bacillus pumilus (BP), Bacillus subtilis (BS), toàn cao, hiệu quả diệt khuẩn tốt, trong Bacillus cereus (BC), Sarcina lutea (Sar). đó có trực khuẩn mủ xanh. MA chủ yếu - Phân lập chủng trực khuẩn mủ xanh sử dụng dƣới dạng dung dịch và dạng từ mẫu bệnh phẩm tại Khoa Hồi sức Cấp kem, dùng đơn lẻ hoặc kết hợp với một cứu, Viện Bỏng Quốc gia. 6 thỏ đực khỏe thuốc kháng khuẩn khác. Viện Bỏng Quốc mạnh, cân nặng 2.000 ± 100 g, đạt tiêu gia đã bào chế thành công dung dịch MA chuẩn thí nghiệm. 5% đạt tiêu chuẩn cơ sở. Vì vậy, nghiên 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. cứu này đƣợc thực hiện nhằm: Bước đầu đánh giá tác dụng háng huẩn in vitro và * Phương pháp đánh giá tác dụng háng tính ích ứng da của chế phẩm, làm cơ huẩn in vitro: sở hoa học cho việc ứng dụng chế phẩm - Xác định vòng vô khuẩn của chế phẩm này trong điều trị BN bỏng. bằng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch đối với một số chủng VK quốc tế. NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƢỢNG VÀ + Tiến hành: các khoanh giấy lọc vô PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU trùng đƣợc tẩm 3 lần với dung dịch mẫu thử, sấy ở nhiệt độ < 60oC đến khô hết 1. Nguyên vật liệu và đối tƣợng dung môi. Cấy vi sinh vật kiểm định vào nghiên cứu. môi trƣờng canh thang, nuôi cấy cho phát * Nguyên vật liệu: triển trong tủ ấm 37oC từ 18 - 24 giờ đến - Dung dịch MA 5% do Viện Bỏng Quốc nồng độ 107 tế bào/ml. Môi trƣờng thạch gia sản xuất, đạt tiêu chuẩn cơ sở. thƣờng vô trùng (làm lạnh về 45 - 500C) 18
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 đƣợc cấy vi sinh vật kiểm định với tỷ lệ - Xác định sơ bộ sự phát triển của 2,5 ml/100 ml. Lắc tròn để vi sinh vật Pseudomonas aeruginosa phân lập tại phân tán đều trong môi trƣờng thạch Viện Bỏng Quốc gia khi tiếp xúc với thuốc thƣờng, đổ vào đĩa petri vô trùng với thể ở các nồng độ khác nhau. tích 20 ml/đĩa, để thạch đông lại. Khoanh Từ dung dịch MA 5%, tiến hành pha giấy lọc đã tẩm chất thử đặt lên bề mặt các dung dịch MA có nồng độ giảm dần môi trƣờng thạch thƣờng chứa vi sinh vật tƣơng ứng với nồng độ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 theo sơ đồ định sẵn. Ủ các đĩa petri có và 1/32 so với nồng độ MA 5%. Hút chính o mẫu thử trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 C xác 1 ml dung dịch này cho vào ống nghiệm trong 18 - 24 giờ. Đọc kết quả, đo đƣờng chứa 100 µl hỗn dịch chứa 108 VK/ml. kính vòng vô khuẩn bằng thƣớc kẹp Cấy hỗn dịch VK và thuốc vào các đĩa Panmer có độ chính xác 0,02 mm. petri thạch thƣờng, để trong tủ ấm ở nhiệt + Đánh giá kết quả: dựa vào đƣờng độ 370C trong 24 giờ. Sau đó, lấy các đĩa kính vòng vô khuẩn và đánh giá theo công petri ra để theo dõi sự phát triển của VK thức sau: trên các đĩa thạch tƣơng ứng với VK tiếp n xúc với thuốc ở nồng độ khác nhau. n 2 Di  (Di ) = i 1 SD = D * Phương pháp đánh giá tính ích ứng D i 1 n n 1 da trên thỏ thực nghiệm: : Đƣờng kính trung bình vòng vô - Thử nghiệm tiến hành trên 6 thỏ. Trên mỗi thỏ, mỗi bên tại vùng da lƣng đã khuẩn, Di: Đƣờng kính vòng vô khuẩn. cạo, đắp thuốc thử dạng dung dịch. Bên SD: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu phải đặt thuốc thử nghiệm, bên trái đặt chỉnh, n: Số thí nghiệm làm song song. dung dịch natri clorid 0,9%. Nhúng đều - Xác định vòng vô khuẩn của chế phẩm lƣợng thuốc thử vào gạc đã tiệt trùng có bằng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch diện tích 2,5 x 2,5 cm. Áp gạc có thuốc đối với Pseudomonas aeruginosa phân thử vào vùng da định thử (đã cạo sạch lập tại Viện Bỏng Quốc gia. lông). Cố định miếng gạc trong 4 giờ để đảm bảo miếng gạc luôn áp vào da thỏ. * Tiến hành: tạo một lỗ có đƣờng kính Sau 4 giờ, bóc gạc, rửa sạch vùng da 10 mm trên bề mặt đĩa thạch. Đổ dung bằng nƣớc cất. Nhận định kết quả sau 4, dịch thử vào lấp đầy lỗ trên bề mặt môi 24, 48, 72 giờ đắp thuốc. trƣờng thạch thƣờng chứa Pseudomonas Đánh giá phản ứng trên chỗ da đặt aeruginosa đã phân lập từ mẫu bệnh phẩm thuốc xem mức độ kích ứng gây ban đỏ tại Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng hoặc phù theo thang điểm đƣợc quy định Quốc gia theo sơ đồ định sẵn. Ủ các đĩa sẵn nhƣ sau: petri có mẫu thử trong tủ ấm ở nhiệt độ - Đánh giá phản ứng của da ở trạng 37oC trong 24 giờ. Sau đó, lấy các đĩa petri thái gây ban đỏ, có vẩy xƣớc (A). ra đọc kết quả. Đo đƣờng kính vòng vô Không có ban đỏ: 0 điểm; ban đỏ rất nhẹ: khuẩn bằng thƣớc chia độ tính bằng mm. 1 điểm; ban đỏ nhận thấy rõ: 2 điểm; ban đỏ 19
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 vừa phải đến nghiêm trọng: 3 điểm; ban 3 điểm; phù nề nghiêm trọng (viền phồng đỏ có vẩy xƣớc nhẹ: 4 điểm. ≥ 1 mm): 4 điểm. - Đánh giá phản ứng của da ở trạng - Đánh giá kết quả: lấy trung bình của thái phù nề (B). 2 điểm A và B là điểm kích ứng da của Không phù nề: 0 điểm; phù nề nhẹ: chế phẩm. Chế phẩm đạt yêu cầu về 1 điểm; phù nề nhẹ có viền phồng: đ ộ kích ứng da có điểm kích ứng da 2 điểm; phù nề vừa phải có viền phồng: bằng 0. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro. * Kết quả xác định vòng vô khuẩn trên các chủng VK qu c tế: Tiến hành đo vòng vô khuẩn khi cho thuốc tiếp xúc với các chủng VK quốc tế. Bảng 1: Kết quả đo vòng vô khuẩn của dung dịch MA trên các chủng VK. VI SINH VẬT MẪU D ˉ(mm) s VI SINH VẬT MẪU D ˉ(mm) s Pseu 2 11,02 0,03 SA 2 10,37 0,65 3 9,29 0,21 3 10,91 0,28 4 3,02 0,12 4 10,00 0,41 5 0,00 0,00 5 0,00 0,00 Chuẩn 10,29 0,24 Chuẩn 15,51 0,37 Pro 2 11,53 0,38 BS 2 17,04 0,54 3 KK 3 18,72 0,72 4 KK 4 21,27 0,52 5 KK 5 18,83 0,31 Chuẩn KK Chuẩn 23,70 0,42 Shi 2 14,07 0,21 BP 2 13,03 0,05 3 11,19 0,80 3 13,87 0,33 4 10,63 0,26 4 3,15 0,26 5 8,03 0,05 5 11,27 0,19 Chuẩn 10,43 0,49 Chuẩn 17,00 0,14 Sal 2 8,97 0,53 Sar 2 14,39 0,29 3 8,80 0,51 3 16,43 0,42 4 8,54 0,04 4 14,20 0,86 5 8,13 0,10 5 9,33 0,24 Chuẩn 12,53 0,23 Chuẩn 25,57 0,45 20
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 EC 2 KK BC 2 10,57 0,46 3 KK 3 8,30 0,20 4 KK 4 11,13 0,09 5 KK 5 0,00 0,00 Chuẩn 17,00 0,82 Chuẩn 21,83 0,85 (Ghi chú: KK: kìm khuẩn). Dung dịch bào chế có tác dụng trên nhiều chủng VK nhƣ: Shigella flexneri, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus và Sarcina lutea. Trong đó, đáng chú ý là thuốc đều có tác dụng kháng VK Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus. Đây là 2 chủng VK hay gặp trên vết bỏng. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu về MA [4, 6]. Ngoài ra, thuốc chỉ có tác dụng kìm khuẩn đối với VK Escherichia coli, Proteus mirabilis. Hình 1a: Vòng vô khuẩn trên Hình 1b: Vòng vô khuẩn trên Pseudomonas aeruginos. Staphylococcus aureus. Hình 1: Hình ảnh vòng vô khuẩn của dung dịch MA trên một số chủng VK (Ghi chú: Mẫu chuẩn: Ở vị trí điểm 0 giờ. Mẫu 2, 3, 4 (từ trái qua phải tính từ mẫu chuẩn): mẫu thử dung dịch MA). * Kết quả đánh giá tác dụng kháng khuẩn Mẫu 1: 5,0 mm; mẫu 2: 7,0 mm; mẫu 3: trên chủng VK phân lập được tại bệnh viện: 7,0 mm. Kết quả xác định vòng vô khuẩn trên Nhƣ vậy, dung dịch MA có tác dụng chủng VK phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia: Lấy mẫu bệnh phẩm từ Khoa Hồi sức kháng khuẩn đối với Pseudomonas Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia và phân lập aeruginosa phân lập tại Viện Bỏng Quốc Pseudomonas aeruginosa. Đây là chủng gia. Đáng chú ý, đây là chủng VK gặp tại VK bệnh viện, có khả năng đề kháng cao khoa Hồi sức Cấp cứu, vì vậy có thể sử với thuốc kháng khuẩn. dụng chế phẩm này trong điều trị BN * Giá trị vòng vô khuẩn của dung dịch MA trên Pseudomonas aeruginosa phân bỏng nặng với mục đích dự phòng nhiễm lập tại Viện Bỏng Qu c gia: trực khuẩn mủ xanh. 21
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 Hình 3b1: Dung dịch MA nồng độ 1/4. Hình 2: Hình ảnh vòng vô khuẩn của dung dịch MA trên Pseudomonas aeruginosa phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia. - Xác định sơ bộ sự phát triển của Pseudomonas aeruginosa phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia khi tiếp xúc với thuốc ở các nồng độ khác nhau. Trên thế giới, dung dịch MA 2,5% đƣợc một số tác giả sử dụng với mục đích đảm bảo hiệu quả điều trị, góp phần làm giảm chi Hình 3b2: Dung dịch MA nồng độ 1/8. phí cho ngƣời bệnh [5]. Để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của dung dịch MA có nồng độ < 5%, chúng tôi tiến hành xác định sơ bộ sự phát triển của chủng trực khuẩn mủ xanh phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia khi tiếp xúc với các dung dịch thuốc có nồng độ giảm dần pha chế từ dung dịch MA 5% ban đầu. Hình 3c1: Dung dịch MA nồng độ 1/16. Hình 3a1: Dung dịch MA nồng độ 1/1. Hình 3c2: Dung dịch MA nồng độ 1/32. Hình 3: Hình ảnh phát triển của Pseudomonas aeruginosa phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia Hình 3a2: Dung dịch MA nồng độ 1/2. khi tiếp xúc với thuốc có nồng độ khác nhau. 22
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 Khi nồng độ của dung dịch MA 5% giảm, hiệu quả kháng khuẩn giảm, thậm chí hầu nhƣ không còn khả năng kháng khuẩn (VK phát triển xâm kín bề mặt thạch). Điều này đƣợc lý giải do sức đề kháng của chủng VK bệnh viện cao và chỉ nhạy cảm với dung dịch MA 5% đƣợc điều chế ở trên. 2. Kết quả đánh giá tính ích ứng da trên thỏ thực nghiệm. Hình 4a2: Thời điểm 72 giờ thuốc chứng. Kết quả da trên da lƣng bình thƣờng của thỏ thực nghiệm. Bảng 2: Điểm đánh giá chỉ tiêu kích ứng da của dung dịch MA trên thỏ thực nghiệm. Sè ®iÓm ban ®iÓm ®iÓm thø tù ®á phï nÒ trung b×nh Thỏ 1 0 0 0 Thỏ 2 0 0 0 Thỏ 3 0 0 0 Thỏ 4 0 0 0 Thỏ 5 0 0 0 Hình 4b1: Thời điểm 0 giờ thuốc thử. Thỏ 6 0 0 0 Dung dịch MA 5% không gây kích ứng da trên cả 6 thỏ khỏe mạnh. Tuy nhiên, khi sử dụng trên da bị tổn thƣơng, cần phải theo dõi tác dụng kích ứng của chế phẩm này, mặc dù giá trị pH khá trung tính (khoảng 6,8). Một số hình ảnh của thí nghiệm thử kích ứng trên da lƣng của thỏ thực nghiệm đƣợc mô tả ở hình 4. Hình 4b2: Thời điểm 72 giờ thuốc thử. Hình 4: Hình ảnh thử tác dụng kích ứng của dung dịch MA trên da lƣng thỏ thực nghiệm. KẾT LUẬN Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra một số kết luận: - Dung dịch MA 5% có tác dụng kìm Hình 4a1: Thời điểm 0 giờ thuốc chứng. khuẩn đối với Escherichia coli, Proteus 23
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2015 mirabilis. Có tác dụng kháng khuẩn đối Viện Bỏng Quốc gia. Tạp chí Y học thảm họa với Shigella flexneri, Salmonella typhi, và Bỏng. 2009, 4, tr.56-62. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus 2. Lê Đức Mẫn. Nghiên cứu một số yếu tố aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, nguy cơ và biện pháp điều trị dự phòng nhiễm Bacillus cereus và Sarcina lutea trên in vitro. khuẩn huyết bỏng tại Viện Bỏng Quốc gia. - Dung dịch MA 5% có tác dụng kháng Luận án Tiến sỹ Y học. Học viện Quân y. Hà Nội. 2007. khuẩn đối với Pseudomonas aeruginosa phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia trên in 3. Lê Năm và CS. Sơ cứu, cấp cứu và điều trị bỏng. NXB Y học. 2006. vitro. VK này vẫn phát triển mạnh khi tiếp xúc với dung dịch MA có nồng độ < 5%. 4. Hashemi B et al. Comparison between topical honey and mafenide acetate in treatment - Dung dịch MA 5% không gây kích of auricular burn. Am J Otolaryngology. 2011, 32, ứng trên da lƣng bình thƣờng của thỏ pp.28-31. thực nghiệm. 5. Ibrahim A et al. A simple cost-saving measure: 2.5% mafenide acetate solution. TÀI LIỆU THAM KHẢO J Burn Care Res, online. 2013. 1. Nguy n Như Lâm, Lê Đức Mẫn. Nghiên 6. Japoni A et al. Pseudomonas aeruginosa: cứu căn nguyên nhiễm khuẩn và mức độ Burn infection, treatment and antibacterial kháng kháng sinh tại Khoa Hồi sức Cấp cứu, resistance. IRC Med J. 2009, 11 (3), pp.244-253. 24