Đánh giá giá trị của hos test trên các mẫu tinh trùng bất động

Nội dung text: Đánh giá giá trị của hos test trên các mẫu tinh trùng bất động

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 ĐÁNH GIÁ GIÁ TRỊ CỦA HOS TEST TRÊN CÁC MẪU TINH TRÙNG BẤT ĐỘNG Nguyễn Thị Thanh Thảo*; Nguyễn Khang Sơn* TÓM TẮT Nghiên cứu đánh giá giá trị của HOS test (Hypo-Osmotic Swelling Test, HOS test, HOST) trên các mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, chúng tôi nhận thấy: - Loại dung dịch áp lực thẩm thấu tối ưu cho nghiệm pháp 50% nước cất/50% môi trường G-IVF. Phản ứng HOS test xảy ra ngay sau khi tinh trùng tiếp xúc với dung dịch thử, phản ứng đầy đủ nhất sau 30 phút. - Với độ nhạy 73,9%, độ đặc hiệu 94,1%, giá trị tiên đoán dương tính 87,4%, HOS test là nghiệm pháp đáng tin cậy cho việc lựa chọn tinh trùng sống trong các mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, phục vụ kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương no n (ICSI - Intra Cytoplasmic Sperm Injection). * Từ khóa: Tinh trùng bất động; HOS test; Tiêm tinh trùng vào bào tương no n. Evaluate the Value of Hypo-Osmotic Swelling Test on Immotile Spermatozoa Samples Summary The study evaluated the value of HOS test for identifying viable sperms on completely immotile spermatozoa samples, we found that: - The optimal hypo-osmotic swelling test solution was 50% distilled water/50% G-IVF medium. HOS test reaction occurred immediately after sperms contacted with the test solution, optimum sperm reaction after 30 minutes. - With a sensitivity of 73.9%, a specificity of 94.1%, a positive predictive value of 87.4%, HOS test is a reliable test to select viable sperms from completely immotile spermatozoa samples for ICSI. * Keywords: Immotile spermatozoa samples; HOS test; Intracytoplasmic sperm injection. ĐẶT VẤN ĐỀ hiện trương phồng lên. Ứng dụng điều Khi đưa tế bào vào trong môi trường này, năm 1984 Jeyendran và CS đ tiến áp lực thẩm thấu thấp (môi trường nhược hành sử dụng dung dịch áp lực thẩm trương), nước sẽ đi vào trong tế bào để thấu thấp để đánh giá tính toàn vẹn cân bằng áp lực giữa bên trong và bên màng bào tương tinh trùng. Trong môi ngoài màng tế bào; tế bào nào sống với trường áp lực thẩm thấu thấp, tinh trùng chức năng màng còn nguyên sẽ có biểu sống sẽ có biểu hiện cuộn và phồng đuôi. * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn khang sơn (khangson@gmail.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017 94
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Ban đầu HOS test chỉ được dùng để đánh của Traphaco (Việt Nam). Eosin Y của giá tỷ lệ sống chết trong mẫu tinh dịch, Merck (CHLB Đức). Các ống Falcon của sau đó được dùng để đánh giá khả năng Corning (Hoa Kỳ). Pipet, lam, lamen, lọ vô thụ tinh của mẫu tinh trùng. Với sự phát trùng đựng tinh dịch, đầu côn. Tủ ấm, triển mạnh mẽ của ngành hỗ trợ sinh sản kính hiển vi. hiện nay, HOS test có vai trò quan trọng * Quy trình nghiên cứu: trong phát hiện tinh trùng sống trong mẫu - Bước chuẩn bị: tinh trùng bất động hoàn toàn với mục + Thu thập mẫu nghiên cứu: thu thập đích sử dụng tinh trùng sống để tiêm vào bào tương của noãn (ICSI). Việc kết hợp mẫu tinh dịch vào lọ nhựa vô trùng, để ly o HOS test với ICSI làm tăng hiệu quả của giải hoàn toàn ở 37 C trước thí nghiệm. chu kỳ ICSI với mẫu tinh trùng bất động + Tạo 3 nhóm dung dịch HOS test áp hoàn toàn [1, 2]. lực thẩm thấu thấp với mức khác nhau. Có nhiều loại dịch áp lực thẩm thấu + Dung dịch 1 (DD1): tỷ lệ nước cất/môi thấp khác nhau, thời gian ủ như thế nào trường 25%/75%. là thích hợp cho phản ứng, giá trị của + Dung dịch 2 (DD2): tỷ lệ nước cất/môi HOS test trên mẫu tinh trùng bất động trường 50%/50%. hoàn toàn cũng chưa được nghiên cứu + Dung dịch 3 (DD3): tỷ lệ nước cất/môi nhiều và sâu. Với mong muốn đánh giá trường 75%/25%. một cách đầy đủ giá trị của HOS test trên + Dung dịch 4 (DD4): tỷ lệ nước cất/môi mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, làm trường 100%/0%. tăng tỷ lệ thành công trong các chu kỳ thụ - Bước 1: sau khi tinh dịch đ ly giải tinh trong ống nghiệm, đặc biệt với mẫu hoàn toàn, tiến hành đánh giá chất lượng tinh trùng bất động hoàn toàn, chúng tôi mẫu tinh dịch theo quy trình thường quy, thực hiện nghiên cứu này nhằm: Đánh giá gồm các thông số mật độ, tỷ lệ sống chết giá trị của HOS test trên các mẫu tinh trùng bằng nhuộm eosin, độ di động, hình thái bất động. theo WHO (2010) [3]. Những mẫu bất động 100% sẽ được tiếp tục thí nghiệm. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP - Bước 2: nghiên cứu lựa chọn loại dung NGHIÊN CỨU dịch HOS test phù hợp, thời gian tối ưu 1. Đối tƣợng nghiên cứu. khi ủ tinh trùng trong dung dịch HOS test. Mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn của - Cho 0,1 ml tinh dịch vào ống Falcon 37 người đàn ông. đựng sẵn 1 ml DD1 đ ủ ấm, trộn đều bằng 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. pipet, ủ ấm. * Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: - Sau 1 phút, nhỏ 10 µl hỗn dịch lên Môi trường G-IVF (gọi tắt là môi trường) lam kính, đếm số lượng tinh trùng có phản của Vitrolife (Thụy Điển). Nước cất tiêm ứng HOS test dương tính trong tổng số 95
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 200 tinh trùng dưới kính hiển vi có độ - Xác định thời gian ủ tinh trùng phù phóng đại 400. Xác định thay đổi tỷ lệ tinh hợp cho phản ứng HOS test tối ưu. trùng sống/chết ngay sau nghiệm pháp - Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán HOS test của hỗn dịch bằng test eosin. dương của HOS test. - Đánh giá lại sau: 5 phút, 10 phút, * Xử lý số liệu: các số liệu thu thập 15 phút, 30 phút, 90 phút, 120 phút. được xử lý theo phương pháp thống kê - Thực hiện tương tự với DD2, DD3, y sinh học theo t-test bằng phần mềm DD4. Microsoft Excel 2010, SPSS 20.0. * Chỉ tiêu nghiên cứu: * Địa điểm và thời gian nghiên cứu: - Tỷ lệ phần trăm tinh trùng có phản ứng nghiên cứu thực hiện tại Bộ môn Mô phôi, HOS test trong các loại dung dịch áp lực Trường Đại học Y Hà Nội từ tháng 10 - thẩm thấu khác nhau. 2016 đến 6 - 2017. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Xác định loại dung dịch HOS test phù hợp và thời gian tối ƣu khi ủ tinh trùng trong dung dịch HOS test. 50 40 30 HOST (+)_dung dịch (%) ệ 1 l ỉ HOST (+)_dung dịch T 20 2 HOST (+)_dung dịch 10 3 HOST (+)_dung dịch 0 4 1 5 10 15 30 90 120 Thời gian (phút) Biểu đồ 1: Tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test ở 4 loại dung dịch khảo sát, biến đổi theo thời gian. - Tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOST (+) tăng dần theo thời gian từ 1 - 30 phút, sau đó ít biến đổi ở tất cả 4 loại dung dịch khảo sát. - Phản ứng phản ứng HOST (+) luôn đạt cao nhất ở DD4, thấp nhất ở DD1; ở DD2 và DD3 gần tương đồng nhau. 96
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 100 80 Eosin (+)_dung dịch 1 60 (%) Eosin (+)_dung dịch 2 ệ l ỉ 40 T Eosin (+)_dung dịch 3 20 Eosin (+)_dung dịch 4 0 1 5 10 15 30 90 120 Thời gian (phút) Biểu đồ 2: Tỷ lệ tinh trùng chết (eosin +) ở mỗi loại dung dịch HOS test, biến đổi theo thời gian. - Tỷ lệ tinh trùng chết tăng dần sau thời gian ủ trong dung dịch HOS test, đặc biệt sau giai đoạn 30 phút. - DD3 và DD4 luôn có tỷ lệ tinh trùng chết cao hơn so với ở DD1 và DD2. Bảng 1: Tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test ở 4 loại dung dịch khảo sát, tại thời điểm 30 phút. DD1 DD2 DD3 DD4 HOST (+) (%) 24,5 30,2 31,9 37,9 Tỷ lệ tinh trùng chết trước HOST test (%) 64,4 64,4 64,4 64,4 Tỷ lệ tinh trùng chết sau HOST test (%) 65,9 67,7 78,1 81,2 - Tại thời điểm 30 phút, DD4 có tỷ lệ tinh trùng HOS test dương tính cao nhất (37,9%); dung dịch DD1 có tỷ lệ tinh trùng phản ứng HOS test thấp nhất (24,5%), khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). - Không có sự khác biệt về tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test ở dung dịch DD2 và DD3. - Tỷ lệ chết của tinh trùng sau HOS test tăng cao ở loại dung dịch DD3 và DD4 (78,1% và 81,2%); khác biệt có ý nghĩa so với DD1 và DD2 (p < 0,01). - DD2 cho phản HOS test rõ và ít ảnh hưởng đến sự sống của tinh trùng. 2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và giá trị chẩn đoán dƣơng của nghiệm pháp HOS test với DD2 tại thời điểm 30 phút. Với loại dịch DD2 (50/50), ủ ở 37oC trong 30 phút, giá trị của phản ứng HOS test của tinh trùng biểu hiện qua bảng 2: 97
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Bảng 2: Giá trị của phản ứng HOS test với DD2. Số ƣợng tinh trùng sống Số ƣợng tinh trùng chết Tổng Tinh trùng HOST (+) 1.897 274 2.171 Tinh trùng HOST (-) 668 4.361 5.029 Tổng 2.565 4.635 7.200 - Độ nhạy của phản ứng HOS test hay tỷ lệ dương tính thật bằng số tinh trùng sống và có HOS test (+) trên tổng số tinh trùng sống (= 73,9%). - Độ đặc hiệu của phản ứng HOS test hay tỷ lệ âm tính thật bằng số tinh trùng chết và có HOS test (-) trên tổng số tinh trùng chết (= 94,1%). - Giá trị tiên đoán dương của phản ứng HOS test bằng số tinh trùng sống và có HOS test (+) trên tổng số tinh trùng có HOS test (+) là 87,4%. BÀN LUẬN lượng nước vào trong tế bào rất lớn, chính vì vậy số tinh trùng có HOS test (+) Khi tinh trùng tiếp xúc với dung dịch áp cao nhất. lực thẩm thấu thấp, tỷ lệ tinh trùng có phản Khi đánh giá loại dịch thẩm thấu thấp ứng HOS test (+) tăng theo thời gian, từ phù hợp, phản ứng HOS test của tinh phút 30 trở đi tỷ lệ tinh trùng có phản ứng trùng ở loại dịch 50% môi trường và 50% HOS test hầu như không thay đổi ở cả nước cất tối ưu nhất. Tối ưu ở đây được bốn loại dịch (biểu đồ 1). Do vậy, khi đánh hiểu là điều kiện mà tỷ lệ tinh trùng có giá lựa chọn loại dịch phù hợp, ta sẽ đánh phản ứng HOS test cao, nhưng đồng thời giá ở thời điểm 30 phút. DD4 có tỷ lệ tinh tỷ lệ tinh trùng chết cũng thấp. Ở loại dịch trùng HOS test dương tính cao nhất (37,9%), 50/50, tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS thấp nhất ở DD1 (24,5%), không có sự test khá cao, đồng thời tổn thương do khác biệt về tỷ lệ tinh trùng có phản ứng stress áp lực thẩm thấu thấp tương đối HOS test ở DD2 và DD3 (bảng 1). Sự thấp, biểu hiện bằng phần trăm tinh trùng khác biệt trên là do các loại dịch có áp lực chết khi nhuộm eosin sau HOS test thấp thẩm thấu khác nhau. Khi tinh trùng ở hơn đáng kể (67,7%) so với loại dịch 100% trong môi trường nhược trương, nước sẽ nước cất (81,2%), p < 0,01 (biểu đồ 2, đi từ ngoài vào trong tế bào cho đến khi bảng 1). đạt được cân bằng về áp lực thẩm thấu giữa trong và ngoài tế bào. Ở loại DD1, Tỷ lệ tinh trùng chết ở loại DD1 và DD2 áp lực thẩm thấu gần với áp lực thẩm sau HOS test thấp nhất so với hai loại thấu của tế bào, lượng nước đi vào tế dịch còn lại, khác biệt có ý nghĩa thống kê bào ít, do vậy số tinh trùng có biểu hiện (p < 0,01), nhưng giữa hai nhóm không có HOS test (+) sẽ thấp. Ở loại dịch 2, với tỷ sự khác biệt đáng kể (p > 0,05). Ngược lại, lệ 50% nước cất, lượng nước đi vào tinh tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test ở trùng ở mức độ đủ để có tỷ lệ tinh trùng loại dịch 100% nước cất tuy cao nhất nhưng biểu hiện HOS test (+) khá cao. Ở loại phần trăm tinh trùng chết sau HOS test dịch 3, 4, với áp lực thẩm thấu rất thấp, cũng cao nhất (81,2%), khác biệt có ý nghĩa 98
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 thống kê (p < 0,01). Tỷ lệ tinh trùng sống thấu thấp, tinh trùng đ có phản ứng HOS ở loại dịch này (18,8%) giảm gần một nửa test, tăng dần theo thời gian, tăng tối ưu so với trước khi thực hiện HOS test (35,6%) ở thời điểm 30 phút so với thời điểm 1 phút, (bảng 1). Có sự khác biệt này là do: ở loại 15 phút đầu, khác biệt có ý nghĩa thống dịch 4, lượng nước đi vào tế bào quá lớn kê (p < 0,05). Ở thời điểm 30 phút, kết quả làm mất cân bằng các thành phần nội bào, HOS test tối ưu nhất (biểu đồ 1, bảng 1). cấu trúc màng tinh trùng bị thay đổi nhiều Tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test dẫn đến tổn thương không thể hồi phục, cao (30,2%), đồng thời tỷ lệ tinh trùng tổn thương chức năng màng tinh trùng, chết thấp (66,3%). Sau 30 phút, tỷ lệ hậu quả là làm chết tinh trùng. Ngược lại tinh trùng có phản ứng HOS test vẫn ở loại DD1, DD2, lượng nước đi vào tế tiếp tục tăng nhẹ và không khác biệt bào ở mức độ vừa phải, sự thay đổi các nhiều so với thời điểm 30 phút (p > 0,05). thành phần nội bào cũng như cấu trúc và Cùng với đó, tỷ lệ tinh trùng chết sau chức năng màng tinh trùng vẫn ở trong HOS test bằng cách nhuộm eosin tăng giới hạn khả năng tinh trùng có thể điều dần theo thời gian, tăng có ý nghĩa ở thời chỉnh được, do vậy số tinh trùng chết sau điểm 90 phút trở đi (p < 0,05) (biểu đồ 2). HOS test thấp hơn hai loại DD3, DD4. Sau 90 phút, tỷ lệ tinh trùng có phản ứng Ở loại DD4 (100% nước cất), tinh trùng HOS test hầu như không tăng và có nguy có phản ứng HOS test mạnh nhất, toàn cơ cao bị chết sau HOS test do tress áp bộ đuôi tinh trùng tròn căng. Những tinh lực thẩm thấu. trùng này có sức sống không bền và thường Khả năng cân bằng áp lực thẩm thấu chết nhanh, do bị stress áp lực thẩm thấu, của mỗi tinh trùng khác nhau. Có tinh trùng biểu hiện bằng tỷ lệ tinh trùng chết sau đạt được cân bằng ngay ở phút đầu tiên, HOS test cao khi nhuộm bằng eosin. nhưng có những tinh trùng cần một thời Trong một số nghiên cứu thực hiện HOS gian dài mới đạt được cân bằng, biểu hiện test trên chu kỳ ICSI cho thấy khả năng bằng tỷ lệ tinh trùng có phản ứng HOS test hồi phục của tinh trùng sau thực hiện cao hơn những thời điểm về sau. Tuy nhiên, HOS test ở môi trường 50/50 khi cho vào càng kéo dài thời gian ở trong môi trường môi trường cân bằng đạt tỷ lệ cao, trong áp lực thẩm thấu thấp, những thay đổi về khi khả năng hồi phục của tinh trùng sau thành phần nội bào, cấu trúc và chức năng HOS test ở môi trường 100% nước cất màng do stress áp lực thẩm thấu thấp rất kém, tinh trùng thường không hồi phục càng ảnh hưởng mạnh đến sự sống của hoặc hồi phục chậm. Tỷ lệ 50/50 được tinh trùng, biểu hiện bằng tỷ lệ tinh trùng cho là phù hợp với kỹ thuật ICSI, với kết chết ngày càng tăng ở những thời điểm quả rất khả quan và thao tác đơn giản, về sau. Thực tế, nhiều nghiên cứu trước dễ thực hiện [4, 5]. đó đ chỉ ra stress do áp lực thẩm thấu Khi nghiên cứu phản ứng HOS test thấp kéo dài có thể dẫn đến những tổn trong các khoảng thời gian khác nhau cho thương không hồi phục và hậu quả là gây thấy có sự biến đổi kết quả phản ứng chết tế bào. Điều này được khẳng định HOS test theo thời gian. Kết quả cho thấy khi tỷ lệ tinh trùng chết tăng cao sau ngay khi cho tinh dịch vào dung dịch thẩm 90 phút [6, 7]. 99
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Trong nghiên cứu cơ bản đánh giá mẫu lựa chọn tinh trùng sống trong các mẫu tinh dịch nói chung, thời gian tinh trùng tinh trùng bất động hoàn toàn phục vụ kỹ tiếp xúc với dung dịch HOS test phù hợp thuật ICSI. nhất 30 phút. Tuy nhiên, khi thực hiện ICSI, thời gian ủ tinh trùng trong dung dịch TÀI LIỆU THAM KHẢO HOS test được khuyến cáo là trong vòng 1. Hồ Mạnh Tường, Đặng Quang Vinh, dưới 1 phút đầu, khi tinh trùng có biểu Vương Thị Ngọc Lan. Thụ tinh trong ống hiện phản ứng HOS test, tiến hành dừng nghiệm. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam. chuyển tinh trùng sang môi trường cân 2011, 1 (1). bằng ngay để tránh các tổn thương do 2. Jeyendran P.S, Van der Ven H.H, stress áp suất thẩm thấu thấp. Lúc này Perez-Pelaez M et al. Development of an tinh trùng đ sẵn sàng cho kỹ thuật ICSI assay to assess the functional integrity of the [7]. human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics. Reproduction. Với giá trị tiên đoán dương 87,4%, có 1984, 70, pp.219-228. nghĩa là khi tinh trùng có phản ứng HOS 3. WHO. WHO laboratory manual for the test, khả năng tinh trùng đó sống 87,4%. examination and processing of human semen. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu World health organization. 2010, fifth. của Buckett (84,2%) [8]. Với độ nhạy 73,9%, 4. Esteves S.C, Sharma R.K, Thomas A.J độ đặc hiệu 94,1%, giá trị tiên đoán dương Jr et al. Suitability of the hypo-osmotic swelling 87,4%, nghiên cứu của chúng tôi đ chứng test for assessing the viability of cryopreserved minh HOS test là nghiệm pháp đáng tin sperm. Science direct. 1996, 66 (5), pp.798-804. cậy cho đánh giá tính toàn vẹn màng bào 5. Verheyen G, Joris H, Crits K et al. tương và tỷ lệ sống chết của tinh trùng; Comparison of different hypo-osmotic swelling đặc biệt có ý nghĩa cho việc lựa chọn tinh solutions to select viable immotile spermatozoa for potential use in intracytoplasmic sperm trùng sống trong các mẫu tinh trùng bất injection. European Society for Human động hoàn toàn phục vụ kỹ thuật ICSI. Reproduction and Embryology. 1997, 3 (3), pp.195-203. KẾT LUẬN 6. Hossain A.M, Rizk B, Barik S et al. Time Nghiên cứu đánh giá giá trị của HOS course of hypo-osmotic swellings of human test trên mẫu tinh trùng bất động hoàn toàn, spermatozoa: evidence of ordered transition chúng tôi nhận thấy: between swelling subtypes. Human reproduction. 1998, 13 (6), pp.1578-1583. - Loại dung dịch áp lực thẩm thấu tối ưu cho nghiệm pháp 50% nước cất/50% 7. Mohammad A.K, Farzaneh M.R, Seyyed M.K. Application of vitality tests on asthenozoospermic môi trường G-IVF. Phản ứng HOS test xảy semen from infertile men. Iranian Biomedical ra ngay sau khi tinh trùng tiếp xúc với dung Journal. 1999, 3 (3 &4), pp.77-81. dịch thử; phản ứng đầy đủ nhất sau 30 phút. 8. Buckett W.M. Predictive value of hypo- - Với độ nhạy 73,9%, độ đặc hiệu 94,1%, osmotic swelling test to identify viable non- giá trị tiên đoán dương tính 87,4%, HOS motile sperm. Human reproduction. 2003, 5 (3), test là nghiệm pháp đáng tin cậy cho việc pp.209-212. 100