Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của chế phẩm ergocalciferol 1,2%

Nội dung text: Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của chế phẩm ergocalciferol 1,2%

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA CHẾ PHẨM ERGOCALCIFEROL 1,2% Nguyễn Văn Long*; Chử Văn Mến* Đặng Trường Giang*; Lê Bạch Mai*** TÓM TẮT Ergocalciferol là một dạng tiền vitamin của vitamin D hay cũn được gọi là vitamin D2. Khi hấp thu vào cơ thể, ergocalciferol sẽ giúp cơ thể hấp thu canxi và photsphat. Viện Dinh dưỡng đã chiết xuất thành công ergocalciferol từ Saccaromyces cerevisiae làm nguyên liệu trong sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm độc tính cấp và bán trường diễn của nguyên liệu ergocalciferol để đánh giá độ an toàn của ergocalciferol. Kết quả nghiên cứu cho thấy: đã xác định được độc tính cấp của ergocalciferol 1,2% do Viện Dinh dưỡng cung cấp trên chuột nhắt trắng theo đường uống với LD50 = 2.025 mg/kg trọng lượng cơ thể. Với liều dùng 200 mg và 400 mg/kg/24 giờ, uống liên tục trong 42 ngày, ergocalciferol không ảnh hưởng đến sự phát triển trọng lượng thỏ, không làm biến đổi điện tim thỏ, không làm biến đổi các chỉ số huyết học (như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và hàm lượng hemoglobin). Các chỉ số đánh giá chức năng gan (hoạt độ AST, ALT), thận (nồng độ ure, creatinin) trong giới hạn bình thường. * Từ khãa: Ergocalciferol; LD50; AST; ALT. EVALUATION OF THE ACUTE AND SUBCHRONIC TOXICITY OF ERGOCALCIFEROL 1.2% SUMMARY Ergocalciferol is provitamin D or vitamin D2. After being absorbed into the body, ergocalciferol helps the body absorb calcium and phosphor. Ergocalciferol has been successfully extracted from Saccaromyces cerevisiae in National Institute of Nutrition as raw material for drug and functional food production. In this study, the acute and subchronic toxicity of ergocalciferol raw material have been evaluated. The results showed that the acute toxicity of ergocalciferol 1.2% from National Institute of Nutrition on mice after oral administration of LD50 = 2.025 mg/kg body weight. At the dosage of 200 mg and 400 mg/kg/24h on rabbit, continuously administrating for 42 days didn’t affect the normal increment of body weight of rabbit, didn’t change the electrocardiogram, hematological indices such as red blood cell, white blood cell, platelet and hemoglobin content, hepatic indices (AST, ALT activity), renal indices (urea, creatinin levels) were within normal limits. * Key words: Ergocalciferol; LD50; AST; ALT. * Học viện Quân y ** Viện Dinh dưỡng Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 16/11/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/12/2013 Ngày bài báo được đăng: 16/12/2013 48
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 ĐẶT VẤN ĐỀ được chia ngẫu nhiên thành 10 lô, mỗi lô 12 Ergocalciferol là một dạng tiền vitamin con. Trước khi cho chuột uống thuốc, chuột của vitamin D, hay còn gọi là vitamin D2, bị bỏ đói trong 16 giờ. Tính liều LD50 theo được sản xuất và lưu hành dưới nhiều biệt phương pháp Behrens - Karber [1, 2, 3]. dược như deltalin, drisdol và calcidol. Chế phẩm nghiên cứu ergocalciferol cho Ergocalciferol có thể được sử dụng như uống với các mức liều như sau: một chất bổ sung vitamin D. Ergocalciferol - Lô thử 1: uống hỗn dịch ergocalciferol chuyển hóa trong cơ thể sẽ đẩy mạnh sự liều 600 mg/kg trọng lượng cơ thể /24 giờ. hấp thụ của canxi và phốt pho tại ruột non. - Lô thử 2: uống hỗn dịch ergocalciferol Do đó, nó nâng cao nồng độ canxi huyết và liều 900 mg/kg trọng lượng cơ thể /24 giờ. nồng độ phosphat. Tuy nhiên các chế phẩm - Lô thử 3: uống hỗn dịch ergocalciferol của vitamin D2 trên thị trường còn đắt so liều 1.200 mg/kg trọng lượng cơ thể /24 giờ. với thu nhập của người Việt Nam. Hiện nay, - Lô thử 4: uống hỗn dịch ergocalciferol Viện Dinh dưỡng, Bộ Y tế đã chiết xuất liều 1.500 mg/kg trọng lượng cơ thể /24 giờ. thành công ergocalciferol từ Saccaromyces cerevisiae góp phần hạ giá thành và đảm - Lô thử 5: uống hỗn dịch ergocalciferol bảo nguồn cung trong nước. Để đánh giá liều 1.800 mg/kg trọng lượng cơ thể /24 giờ. độ an toàn, chúng tôi tiến hành thử độc tính - Lô thử 6: uống hỗn dịch ergocalciferol cấp và bán trường diễn của sản phẩm này. liều 2.100 mg/kg trọng lượng cơ thể /24 giờ. - Lô thử 7: uống hỗn dịch ergocalciferol NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG liều 2.400 mg/kg trọng lượng cơ thể /24 giờ. PHÁP NGHIÊN CỨU - Lô thử 8: uống hỗn dịch ergocalciferol 1. Nguyên liệu, đối tƣợng nghiên cứu. liều 2.700 mg/kg trọng lượng cơ thể /24 giờ. - Nguyên vật liệu: chế phẩm ergocalciferol - Lô thử 9: uống hỗn dịch ergocalciferol 1,2% đạt tiêu chuẩn cơ sở, do Viện Dinh liều 3.000mg/kg trọng lượng cơ thể /24 giờ. dưỡng cung cấp. - Lô thử 10: uống hỗn dịch ergocalciferol - Đối tượng nghiên cứu: chuột nhắt trắng liều 3.300mg/kg trọng lượng cơ thể /24 giờ. có trọng lượng cơ thể từ 20,0 - 22,0 g; thỏ: * Độc tính bán trường diễn: theo phương 36 con trọng lượng từ 1,8 - 2,2 kg/con. Tất pháp Abraham, quy định của Tổ chức Y tế Thế cả động vật thí nghiệm do Ban Chăn nuôi, giới và Bộ Y tế về hiệu lực và an toàn thuốc Học viện Quân y cung cấp, được nuôi [1, 3, 5]. Chia thỏ thành 3 lô, mỗi lô 12 con: dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm - Lô chứng: uống dung dịch natri clorid của Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học 0,9%, liều 2,0 ml/kg/24 giờ, uống liên tục quân sự, Học viện Quân y, ăn theo tiêu trong 42 ngày. chuẩn thức ăn cho động vật nghiên cứu, nước (đun sôi để nguội) uống tự do. - Lô thử liều 1: uống ergocalciferol mức liều 200 mg/kg/24 giờ, uống liên tục trong 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. thời gian 42 ngày. * Độc tính cấp: theo quyết định số - Lô thử liều 2: uống ergocalciferol mức 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996 của Bộ Y tế và liều 400 mg/kg/24 giờ, uống liên tục trong của WHO về xác định độ an toàn cho các thời gian 42 ngày. chế phẩm có nguồn gốc thiên nhiên. Chuột 51
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Cho tất cả thỏ nghiên cứu uống cùng tim, xét nghiệm sinh hóa AST, ALT, ure, một thể tích. Thời gian uống liên tục trong creatinin. Làm tiêu bản giải phẫu bệnh gan, 42 ngày. Sau đó, kiểm tra lại cân nặng, điện lách, thận. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Độc tính cấp. Bảng 1: Kết quả nghiên cứu độc tính cấp. n (mg/kg träng l•îng c¬ thÓ/24 giê) 600 12 0 12 900 12 1 11 1.200 12 2 10 1.500 12 3 9 1.800 12 4 8 2.100 12 6 6 2.400 12 8 4 2.700 12 10 2 3.000 12 11 1 3.300 12 12 0 Sau 72 giờ uống chế phẩm, không thấy chuột thí nghiệm nào chết ở tất cả lô nghiên cứu. Tuy nhiên, chuột có biểu hiện xù lông, có hiện tượng đi ngoài, phân bết lại ở hậu môn. Đến ngày thứ tư trở đi thấy xuất hiện chuột chết (ở liều cao nhất 3.300 mg/kg/24 giờ sau 3 ngày kể từ khi uống thuốc, chuột chết hoàn toàn). Toàn bộ gan, lách, thận xung huyết nhẹ, dạ dày có hơi, đọng lại thức ăn và xung huyết. Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi tính được LD50 của chế phẩm trên chuột nhắt trắng là 2.025 mg/kg trọng lượng cơ thể/24 giờ. 2. Độc tính bán trƣờng diễn. Bảng 2: Trọng lượng cơ thể thỏ trước và sau khi uống thuốc. Ergocalciferol liÒu Ergocalciferol liÒu Chøng p 1 (2) 2 (3) (kg) (1) (2) (3) n 12 12 12 p2-1 > 0,05 Tr•íc thÝ nghiÖm (a) X 2,00 1,99 1,98 p3-2 > 0,05 SD 0,12 0,13 0,12 p3-1 > 0,05 52
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 (1) (2) (3) (4) (5) (6) n 12 12 12 p2-1 > 0,05 Sau 3 tuần (b) 2,10 2,09 2,08 p3-2 > 0,05 x p3-1 > 0,05 SD 0,12 0,13 0,12 n 12 12 12 p2-1 > 0,05 Sau 6 tuần (c) 2,22 2,21 2,20 p3-2 > 0,05 p3-1 > 0,05 SD 0,12 0,11 0,10 p pb-a < 0,05; pc-b < 0,05; pc-a < 0,05 So sánh trọng lượng cơ thể của thỏ ở hai lô dùng ergocalciferol với lô chứng sinh học tại các thời điểm thấy thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). So sánh giữa các thời điểm sau so với trước thấy trọng lượng cơ thể thỏ của ba lô tăng, sự thay đổi có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả trên chứng tỏ chế phẩm ergocalciferol ở cả 2 mức liều không ảnh hưởng đến phát triển cân nặng bình thường của thỏ. Bảng 3: Điện tim thỏ sau khi dùng ergocalciferol. T h ê i L « ErgocalciferolErgocalcifero p x Ð t (1) l i Ò u l i Ò u Tần số tim (CK/phút, ± SD) t0 (a) 265,88 ± 37,62 260, 38 ± 50, 37 270,00 ± 33,82 p2-1 > 0,05 t3 (b) 264,00 ± 36,02 260,75 ± 49,29 270,63 ± 22,07 p3-2 > 0,05 t6 (c) 264,88 ± 37,10 259,50 ± 49,07 265,38 ± 33,50 p3-1 > 0,05 pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 - QRS (mV) t0 (a) 0,354 ± 0,063 0,356 ± 0,092 0.363 ± 0,066 p2-1 > 0,05 t3 (b) 0,355 ± 0,061 0,358 ± 0,089 0,361 ± 0,064 p3-2 > 0,05 t6 (c) 0,356 ± 0,061 0,359 ± 0,097 0,360 ± 0,052 p 3-1 > 0,05 pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 - Sóng bất thường Không Không Không - So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và so sánh giữa các lô ở cùng một thời điểm, tần số và biên độ của điện tim thỏ thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Không có sóng bất thường trên điện tim của các lô thỏ tại thời điểm nghiên cứu. Kết quả trên chứng tỏ chế phẩm ergocalciferol ở cả 2 mức liều không ảnh hưởng tới điện tim thỏ. Bảng 4: Số lượng hồng cầu thỏ ở các lô nghiên cứu (n = 12). 52
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 T h ê i Sè (x1012/l, ± SD) x Ð t L« chøng (1) Ergocalciferol liÒu 1 (2) Ergocalciferol liÒu 2 (3) p t (a) 4,64 ± 0,41 4,94 ± 0,71 5,22 ± 0,75 0 x p2-1 > 0,05 t3 (b) 5,06 ± 0,57 4,83 ± 0,59 5,24 ± 0,26 p3-2 > 0,05 p > 0,05 t6 (c) 4,92 ± 0,50 4,80 ± 0,19 5,05 ± 0,24 3-1 p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và so sánh giữa các lô ở cùng một thời điểm, số lượng hồng cầu thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Bảng 5: Ảnh hưởng của ergocalciferol đối với huyết sắc tố thỏ (n = 12). Hµm tè T h ê i L« chøng (1) Ergocalciferol liÒu 1 (2) Ergocalciferol liÒu 2 (3) p x Ð t n = 12 n = 12 n = 12 t (a) 107,38 ± 7,35 110,00 ± 10,47 115,50 ± 14,37 0 p2-1 > 0,05 t3 (b) 115,63 ± 12, 12 109,13 ± 10,99 114,38 ± 8,09 p3-2 > 0,05 p > 0,05 t6 (c) 111,63 ± 8,63 112,13 ± 6,38 113,75 ± 7,50 3-1 p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và giữa các lô ở cùng một thời điểm, hàm lượng huyết sắc tố thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Bảng 6: Ảnh hưởng của ergocalciferol đối với số lượng bạch cầu thỏ. Sè G/l) T h ê i L« chøng (1) Ergocalciferol liÒu 1 (2) Ergocalciferol liÒu 2 (3) p x Ð t n = 12 n = 12 n = 12 Trước thí nghiệm 5,99 ± 2,10 5,91 ± 2,50 6,99 ± 0,82 (a) p2-1 > 0,05 p > 0,05 Sau 3 tuần (b) 6,29 ± 1,87 6,19 ± 1,96 6,91 ± 0,97 3-2 p3-1 > 0,05 Sau 6 tuần (c) 6,44 ± 1,80 6,05 ± 1,45 7,01 ± 0,71 p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và so sánh giữa các lô ở cùng một thời điểm, số lượng bạch cầu thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). 53
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Bảng 7: Ảnh hưởng của ergocalciferol đối với số lượng tiểu cầu thỏ (n = 12). T h ê i ErgocalciferolErgocalcifer o l L« p x Ð t l i Ò u l i Ò u t (a) 452,25 ± 123,83 437,63 ± 131,81 459, 38 ± 124,54 0 p2-1 > 0,05 t3 (b) 503, 38 ± 83,25 441,25 ± 130,39 481,75 ± 204,42 p3-2 > 0,05 p > 0,05 t6 (c) 472,29 ± 168,91 451,00 ± 112,57 452,43 ± 89,62 3-1 p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và so sánh giữa các lô ở cùng một thời điểm, số lượng tiểu cầu thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, chế phẩm ergocalciferol ở cả 2 mức liều không ảnh hưởng tới các chỉ số huyết học bình thường của thỏ. Bảng 8: Hoạt độ enzym AST (IU/l) của các lô thỏ nghiên cứu (n = 12). Ergocalciferol Ergocalciferol T h ê i L « ( L i Ò u L i Ò u p X Ð t n = 12 n = 12 n = 12 57,51 ± 18,98 58,04 ± 19,58 58,09 ± 19,63 t0 (a) p2-1 > 0,05 t3 (b) 57,73 ± 17,06 57,65 ± 19,86 58, 31 ± 16,38 p3-2 > 0,05 p > 0,05 t6 (c) 57,91 ± 18,84 57,70 ± 17,73 57,84 ± 17,27 3-1 p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và so sánh giữa các lô ở cùng một thời điểm, hoạt độ enzym AST thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Bảng 9: Hoạt độ enzym ALT (IU/l) của các lô nghiên cứu (n = 12). L « Ergocalciferol Ergocalciferol T h ê i ( l i Ò u l i Ò u( p x Ð t n = 12 n = 12 n = 12 t (a) 112,38 ± 16,52 111,75 ± 16,30 112,50 ± 16,58 0 p2-1 > 0,05 t3 (b) 112,13 ± 18,07 111,88 ± 14,50 112,75 ± 17,07 p3-2 > 0,05 p > 0,05 t6 (c) 112,88 ± 20,36 112,00 ± 13,61 112,63 ± 12,48 3-1 p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và so sánh giữa các lô ở cùng một thời điểm, hoạt độ enzym ALT thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, hoạt chế phẩm ergocalciferol cho thỏ uống đều đặn ở cả 2 mức liều đều không ảnh hưởng tới hoạt độ các enzym AST và ALT. Điều đó chứng tỏ chế phẩm an toàn và không ảnh hưởng tới chức năng gan. 54
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Bảng 10: Hàm lượng creatinin (mmol/l) máu thỏ ở các lô nghiên cứu (n = 12). T h ê i L «høng Ergocalciferol 1 Ergocalciferol 2 p x Ð t ( x ( ( t0 (a) 53,75 ± 8,45 54,25 ± 9,68 53,38 ± 9,66 p2-1 > 0,05 p3-2 > 0,05 t3 (b) 53,63 ± 8,70 54,13 ± 8,48 54,25 ± 7,38 p3-1 > 0,05 t6 (c) 53,88 ± 8,82 54,25 ± 9,42 54,50 ± 8,42 p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và so sánh giữa các lô ở cùng một thời điểm, hàm lượng creatinin máu thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Bảng 11: Ảnh hưởng của ergocalciferol đối với ure máu thỏ (n = 12). T h ê i N å n g ure mmol/l,± x Ð t L« chøng (1) Ergocalciferol liÒu 1 (2) Ergocalciferol liÒu 2 (3) p t0 (a) 3,51 ± 1,08 3,49 ± 1,13 3,46 ± 1,04 p2-1 > 0,05 t3 (b) 3,53 ± 0,95 3,43 ± 0,84 3,44 ± 0,90 p3-2 > 0,05 p3-1 > 0,05 t6 (c) 3,53 ± 1,16 3,50 ± 0,61 3,40 ± 0,87 p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và so sánh giữa các lô ở cùng một thời điểm, hàm lượng ure máu thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Chế phẩm ergocalciferol cho thỏ uống liên tục trong thời gian 3 tuần và 6 tuần ở cả 2 mức liều không ảnh hưởng tới nồng độ creatinin và ure máu thỏ, chứng tỏ chế phẩm an toàn đối với chức năng thận khi dùng kéo dài. Để đánh giá chi tiết hơn, chúng tôi tiến nguyên vẹn màu sắc ở hai lô dùng hành nghiên cứu mô bệnh học gan, thận và ergocalciferol không khác so với lô chứng. lách thỏ sau khoảng thời gian thí nghiệm. - Quan sát vi thể: sau khi quan sát đại * Mô bệnh học gan, thận và lách của thỏ thí nghiệm: thể, cắt rời gan, thận. Sau đó, ngâm vào - Quan sát đại thể: sau khi mổ thỏ, quan sát dung dịch formol 10%, làm tiêu bản và quan thấy hình thái của gan, thận bình thường, sát dưới kính hiển vi.. 55
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 (a) (b) (c) Hình 1: Hình ảnh gan thỏ thực nghiệm (HE, 100X) (a): lô dùng liều 1, (b): lô dùng liều 2; (c): lô chứng. a b c Hình 2: Hình ảnh mô bệnh học thận thỏ thực nghiệm (HE, 100X) (a): lô dùng liều 1, (b): lô dùng liều 2; (c): lô chứng. - Lô chứng: các bè gan và tiểu thùy gan trúc vùng vỏ, vùng tủy, cầu thận bình thường, không thay đổi về cấu trúc. Tế bào gan không thấy hình ảnh tổn thương. không có tổn thương thoái hóa, không có Như vậy, ergocalciferol dùng đường uống xâm nhập viêm. Cấu trúc vùng vỏ, vùng tủy, liên tục trong 42 ngày không gây tổn thương cầu thận bình thường, không có tổn thương. trên gan, thận, lách của thỏ. - Lô thử (liều 1 và liều 2): thùy gan và bè KẾT LUẬN gan không thay đổi về cấu trúc. Tế bào gan không có tổn thương thoái hóa. Tĩnh mạch Đã xác định được độc tính cấp của trung tâm không giãn, không xung huyết. ergocalciferol trên chuột nhắt trắng theo Khoang cửa không có xâm nhập viêm. Cấu đường uống với LD50 là 2,025 mg/kg/24 giờ. Với liều 200 mg và 400 mg/kg/24 giờ, uống 56
9. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 liên tục trong 42 ngày, ergocalciferol 1,2% TÀI LIỆU THAM KHẢO không ảnh hưởng đến sự phát triển trọng 1. Bộ Y tế. Quy chế đánh giá tính an toàn lượng thỏ, không biến đổi điện tim thỏ, không và hiệu lực thuốc cổ truyền. Quyết định số biến đổi các chỉ số huyết học như hồng cầu, 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996. 1996. bạch cầu, tiểu cầu và hàm lượng hemoglobin, 2. Đỗ Trung Đàm. Phương pháp xác định các chỉ số đánh giá chức năng gan (hoạt độ độc tính cấp của thuốc. Nhà xuất bản Y học. AST, ALT), thận (nồng độ ure, creatinin) trong giới hạn bình thường. Hình ảnh mô bệnh học 3. Abrham W.B. Techniques of animal and clinical gan, thận thỏ bình thường. toxicology, Med. Pub. Chicago, 1978, pp.55-68. 4. Turner A. Screening methods in pharmacology. Academic Press. New York and London. 1965, pp.60-68. 5. WHO. Research guidelines for evaluating the safety and efficacy of herbal medicines. Manila. Philipin. 1993, pp.35-41. 57
10. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 58