Danh_gia_chat_luong_va_co_che_tac_dung_9521_2025303_20180817_111215

Nội dung text: Danh_gia_chat_luong_va_co_che_tac_dung_9521_2025303_20180817_111215

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VÀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA GLOBULIN MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU NGUỒN GỐC TỪ TRỨNG GÀ KHÁNG ĐỘC TỐ TẢ (CHOLERA TOXIN) Hoàng Trung Kiên*; Nguyễn Đặng Dũng* TÓM TẮT Theo một số nghiên cứu gần đây trên động vật thực nghiệm, kháng thể kháng độc tố tả (ĐTT) (cholera toxin) hoặc kháng tiểu phần B của ĐTT (CT-B subunit) có thể được sử dụng như là một biện pháp tạo miễn dịch thụ động đặc hiệu nhằm điều trị và/hoặc dự phòng trường hợp nhiễm vi khuẩn (VK) tả đường tiêu hóa. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát chất lượng và có chế tác dụng của kháng thể IgY kháng ĐTT được phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên ĐTT. Kết quả cho thấy kháng thể IgY kháng độc tố VK tả phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch thể hiện hoạt tính đặc hiệu với độc tố VK tả trên in vitro, ngăn không cho độc tố gắn vào thụ thể GM1. * Từ khóa: Độc tố tả; Kháng thể IgY. Study on quality and mechanism of action of yolk immunoglobulin (IgY) specific to cholera toxin Summary Recently, several papers revealed that antibodies against cholera toxin (CT) or CT-B subunit showed protective effect when used as preventive or therapeutic method on animal models orally infected with V.cholerae. In the present study, we investigated the purity and tested the reactivity of IgY isolated from eggs laid of previously immunized hens. The results showed that the IgY preparation isolated from eggs laid of immunized hens was relatively pure and could inhibit binding of CTB with GM1 in vitro. * Key words: Cholera toxin; Immunoglobulin Y (IgY). ĐẶT VẤN ĐỀ theo đường tiêu hóa. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công bố năm 2013, trong năm 2012 đã ghi nhận 245.393 Bệnh tiêu chảy là một trong những nguyên trường hợp mắc bệnh tả tại tất cả các châu nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn cầu, lục trên toàn thế giới, với 3.034 trường hợp chủ yếu ở trẻ em, đặc biệt các quốc gia đang tử vong [7]. Cơ chế bệnh sinh của bệnh có phát triển. Một trong những tác nhân gây tiêu sự tham gia của ĐTT (cholera toxin - CT), chảy cấp là nhiễm K tả (Vibrio cholerae) * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đặng Dũng (dzungmd@yahoo.com) Ngày nhận bài: 30/11/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/12/2013 Ngày bài báo được đăng: 16/12/2013 7
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 do VK tả tiết ra sau khi nhiễm vào ruột bệnh nguyên là 0,1 mg/ml, sau đó gây miễn dịch nhân; ĐTT gây tổn thương tế bào niêm mạc cho gà mái, thu hoạch trứng và tách chiết ruột, làm tăng tiết dịch tại ruột, dẫn đến ỉa kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng theo các chảy cấp. Một số nghiên cứu gần đây cho quy trình đã được mô tả trong nghiên cứu thấy, bên cạnh các biện pháp dự phòng và trước của chúng tôi [1]. điều trị kinh điển khi nhiễm VK tả (như sử * Kiểm tra khả năng gắn kết của CT-B dụng vắcxin, bổ sung nước, điện giải; sử với GM1 in vitro: dụng kháng sinh), việc sử dụng kháng thể - Gắn GM1 lên phiến ELISA: ủ 50 µl GM1 đặc hiệu với VK tả hoặc với ĐTT có thể là (100 pmol/ml) trong mỗi giếng của phiến một biện pháp dự phòng và/hoặc điều trị ELISA, thời gian 2 giờ ở nhiệt độ phòng. đặc hiệu có tác dụng bảo vệ rõ rệt trên mô - Tiến hành phản ứng: bổ sung vào mỗi hình động vật thực nghiệm nhiễm VK tả giếng 50 µl cộng hợp HRP-CTB ở những đường tiêu hóa [4, 6]. nồng độ khác nhau, sao cho lượng CTB Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo trong mỗi giếng lần lượt là 1,25; 2,5 và 5 sát độ tinh sạch, đồng thời đánh giá hoạt ng; rửa giếng bằng PBS-T, sau đó bổ sung tính kháng thể IgY phân lập từ trứng gà vào mỗi giếng 50 µl OPD (0,5 mg/ml, mỗi được gây miễn dịch với ĐTT trên in vitro. 50 ml OPD bổ sung thêm 20 µl H2O2 ngay trước khi sử dụng); ủ phiến ELISA ở nhiệt ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP độ phòng 15 phút trong bóng tối; ngừng NGHIÊN CỨU phản ứng bằng cách bổ sung 50 ul HCl 2N. 1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu. - Đo mật độ quang (OD) của các giếng tại bước sóng 492 nm. - Độc tố VK tả (cholera toxin- CT) (Sigma, Hoa Kỳ). * Ph¶n øng ELISA đánh giá hoạt tính của - Hoá chất, sinh phẩm chủ yếu: hóa chất kháng thể IgY kháng CT-B: chạy điện di SDS-PAGE; GM1, cộng hợp CTB - Ủ 50 µl GM1 (100 pmol/ml) trong mỗi giếng (cholera toxin-B subunit)- HRP (horse radish của phiến ELISA trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. peroxidase) (Bio-Rad, Hoa Kỳ; Sanofi, Pháp). - Bổ sung cộng hợp HRP-CTB cùng với 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. kháng thể IgY phân lập từ lòng đỏ trứng gà * Gây miễn dịch cho gà mái với kháng gây miễn dịch với kháng nguyên CT. Giếng đối nguyên ĐTT và phân lập IgY: chứng âm, sử dụng BSA thay cho IgY. Bên cạnh đó, I Ig (intravenous immunoglobulin) được - Tạo kháng nguyên ĐTT: trộn huyền sử dụng như đối chứng dương trong thí nghiệm. dịch ĐTT với tá chất freund hoàn chỉnh hoặc không hoàn chỉnh (tỷ lệ 1:1 về thể - Rửa phiến ELISA bằng PBS-T. Bổ sung tích); nồng độ ĐTT trong huyền dịch kháng vào mỗi giếng 50 µl OPD (0,5 mg/ml, mỗi 50 ml 8
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 OPD bổ sung thêm 20 µl H2O2). Ủ phiến khoảng 70 kDa và 35 kDa, tương ứng với ELISA trong bóng tối 15 phút ở nhiệt độ chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L) của IgY. phòng; ngừng phản ứng bằng cách bổ sung 2. Khả năng gắn kết của CTB với GM1 50 ul HCl 2N. Đo OD của các giếng tại bước in vitro. sóng 492 nm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Độ tinh sạch của chế phẩm IgY sau phân lập. Đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm IgY sau thẩm tích loại muối bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính protein. CT-B concentration (ng/well Hình 2: Khả năng gắn kết của CTB với GM1 in vitro. Kết quả thí nghiệm cho thấy ở các nồng độ khác nhau, CTB đều thể hiện khả năng gắn kết đặc hiệu với GM1 in vitro. 3. Tác dụng của IgY ức chế gắn kết của CTB với GM1. Hình 1: Kết quả điện di SDS-PAGE trong Hình 3: Tác dụng của IgY ức chế gắn kết điều kiện biến tính IgY. CTB- GM1 in vitro. (GM1: 5 pmol/giếng; CTB: 5 ng/giếng). Kết quả cho thấy, sản phẩm IgY thu được sau thẩm tích loại bỏ muối amoni sulfate có độ tinh sạch cao, với 2 băng trên điện di SDS-PAGE có trọng lượng lần lượt 9
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 tạo ra thể hiện hoạt tính ức chế gắn kết của CTB với GM1 mạnh hơn rõ rệt so với hoạt tính của IVIg: ở tất cả các nồng độ CTB được khảo sát, IgY đều thể hiện tác dụng ức chế. Lý do có được kết quả này là do IgY sử dụng trong thí nghiệm là sản phẩm thu được sau gây miễn dịch đặc hiệu với Hình 4: Tác dụng của IgY ức chế gắn kết CT. Do đó, IgY có khả năng gắn kết đặc CTB- GM1 in vitro. hiệu với CTB, dẫn đến ức chế gắn kết của (GM1: 5 pmol/giếng; CTB: 1 ng/giếng) CTB với GM1. Hoạt tính này của IgY kháng ĐTT có thể là một cơ chế tác dụng của IgY đặc hiệu với CT tạo ra hiệu quả bảo vệ: IgY ức chế gắn của CTB với thụ thể GM1 trên tế bào niêm mạc ruột, do đó ngăn chặn ĐTT bám lên màng tế bào niêm mạc ruột, cuối cùng, giảm tác động gây tổn thương tế bào niêm mạc ruột của ĐTT. Bằng phương pháp gây miễn dịch trên gà mái và thu thập kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng của gà gây miễn dịch, Hoàng Trung Hình 5: Tác dụng của IgY ức chế gắn kết Kiên và CS đã thu được IgY từ lòng đỏ CTB- GM1 in vitro. trứng gà kháng K E. ictaluri (gây bệnh mủ (GM1: 5 pmol/giếng; CTB: 0,2 ng/giếng) gan cá tra) [1], hoặc kháng thể đặc hiệu với Kết quả phản ứng ELISA cho thấy: kháng VK tả [2]. Tim Sunnary và CS với phương thể IgY thu được từ lòng đỏ trứng gà gây pháp tương tự đã thu được kháng thể IgY miễn dịch bằng độc tố VK tả phản ứng đặc kháng trực khuẩn mủ xanh, có tác dụng ức hiệu với CTB, đồng thời thể hiện tác dụng chế trực khuẩn mủ xanh trên mô hình vết ức chế sự gắn kết của CTB với GM1, trong thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm trực khi BSA (đối chứng âm) không thể hiện tác khuẩn mủ xanh [3]. dụng này. I Ig chỉ thể hiện tác dụng ức chế Trong nghiên cứu này, gây miễn dịch gắn kết của CTB với GM1 khi nồng độ CTB cho gà mái với kháng nguyên là ĐTT tự là 1,0 và 0,2 ng/giếng (hình 4, 5), không thể nhiên (CT), cho phép phân lập được kháng hiện tác dụng này ở nồng độ CTB 5 ng/giếng thể IgY từ trứng của gà được gây miễn (hình 3). Việc sử dụng I Ig như đối chứng dịch, có phản ứng đặc hiệu với CTB. Theo dương trong thí nghiệm này dựa vào kết một số nghiên cứu gần đây, kháng thể IgY quả nghiên cứu của Yuki N. và CS (1996) đặc hiệu với kháng nguyên CT-B, thể hiện công bố, trong đó, nhóm nghiên cứu nhận tác dụng bảo vệ trên mô hình động vật thí thấy I Ig có tác dụng ngăn cản sự gắn kết nghiệm nhiễm VK tả theo đường tiêu hóa của ĐTT với GM1 in vitro [5]. Kết quả nghiên [4]. Kết quả thu được trong nghiên cứu này cứu cho thấy chế phẩm IgY do chúng tôi gợi ý: IgY đặc hiệu với kháng nguyên ĐTT (CT) và/hoặc CTB thể hiện tác dụng bảo vệ 10
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 trên mô hình động vật nhiễm VK tả đường thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh trên vết tiêu hóa thông qua cơ chế ức chế gắn kết thương bỏng thực nghiệm nhiễm trực khuẩn mủ của CTB với GM1. xanh. Tạp chí Y - Dược học quân sự. 2011, tập 36, số 8, tr.44-49. 4. Hirai K, Arimitsu H, Umeda K. Passive oral KẾT LUẬN immunization by egg yolk immunoglobulin (IgY) Chế phẩm kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng to Vibrio cholerae effectively prevents cholera. gà được gây miễn dịch với kháng nguyên ActaMedica Okayama. 2010, 64 (3), pp.163-170. CT tương đối tinh khiết, có tác dụng ức chế 5. Nobuhiro Yuki, Fuminori Myiagi. Possible sự gắn kết của CTB với GM1 in vitro. mechanism of intravenous immunoglobulin treatment KẾT LUẬN on anti-GM1 antibody-mediated neuropathies. Journal of the Neurological Sciences. 1996, Vol. 1. Hoàng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại, Nguyễn 139, Issue 1, pp.160-162. Ngọc Tuấn. Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan ở 6. Osek J, Jonson G, Svennerholm AM, cá tra bằng công nghệ tạo kháng thể IgY gà. Holmgren J. Role of antibodies against biotype- Tạp chí Thông tin y dược. 2010, số 3, tr.71-76 specific Vibrio cholerae pili in protection against 2. Hoàng Trung Kiên, Lê Thu Hồng, Lê Thu experimental classical and El Tor cholera. Infect Hà, Nguyễn Đặng Dũng. Nghiên cứu quy trình Immun. 1994, 62 (7), pp.2901-2907. gây miễn dịch tạo kháng thể IgY kháng K tả 7. World Health Organization. Cholera, 2012. (Vibrio cholerae) trên gà mái. Tạp chí Y - Dược Weekly Epidemiological Record. 2013, Vol 88, học quân sự. 2013, tập 38, số 1,tr. 46-51. No 31, pp.321-336. 3. Tim Sunnary, Đỗ Minh Trung, Lê Thu Hồng, Lê Văn Đông. Tác dụng in vivo của kháng 11
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 12