Đánh giá bất thường cô đặc nhiễm sắc thể tinh trùng bằng nhuộm aniline blue

Nội dung text: Đánh giá bất thường cô đặc nhiễm sắc thể tinh trùng bằng nhuộm aniline blue

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 ĐÁNH GIÁ BẤT THƢỜNG CÔ ĐẶC NHIỄM SẮC THỂ TINH TRÙNG BẰNG NHUỘM ANILINE BLUE Nguyễn Thanh Hoa*; Phan Nữ Thục Hiền* TÓM TẮT Mục tiêu: thử nghiệm nhuộm aniline blue (AB) đánh giá mức độ cô đặc nhiễm sắc thể (NST) tinh trùng. Đối tượng và phương pháp: 40 mẫu tinh dịch chất lượng bình thường theo tiêu chuẩn WHO (2010). Tiến hành nhuộm AB đánh giá mức độ cô đặc NST. Xem xét mối liên quan giữa mức độ cô đặc NST tinh trùng và hình thái tinh trùng. Kết quả: nhuộm AB cho hình ảnh tinh trùng bất thường cô đặc NST có đầu bắt màu thuốc nhuộm, tinh trùng bình thường cô đặc NST không bắt màu thuốc nhuộm. Không có mối liên quan giữa bất thường hình thái và bất thường cô đặc NST tinh trùng. Kết luận: có thể sử dụng nhuộm AB đánh giá mức độ cô đặc NST tinh trùng như một xét nghiệm độc lập không liên quan đến hình thái tinh trùng. * Từ khóa: Cô đặc nhiễm sắc thể tinh trùng; Nhuộm aniline blue; Hình thái tinh trùng. Assessment of Mature Sperm by Aniline Blue Stain Summary Objectives: Aniline blue stain test evaluated sperm chromatin condensation or sperm nucleus maturity. Subjects and methods: 40 semen samples with normal quality semen according to WHO 2010 standard. Using AB stain to evaluate chromatin condensation sperm. Assess the relationship between abnormal chromatin condensation and abnormal sperm morphology. Results: Abnormal chromatin condensation sperms (immature chromatin sperms) had blue-stained nucleus, normal chromatin condensation (mature sperm) had unstained nucleus. There is no correlation between sperm morphology and sperm maturity. Conclusion: AB stain can be used to assess sperm chromatin condensation as an independent test that does not involve sperm morphology. * Keywords: Sperm chromatin condensation; Aniline blue stain; Morphology sperm. ĐẶT VẤN ĐỀ bảo vệ vật chất di truyền, đảm bảo chức năng sinh sản của tinh trùng. Quá trình này Vô sinh nam chiếm một nửa nguyên gồm có sự thay đổi các histone trong ADN nhân gây vô sinh nói chung. Tinh dịch đồ là bằng biến thể histone, sau đó là protein xét nghiệm đầu tiên được chỉ định để chẩn chuyển tiếp và cuối cùng là protamine [1]. đoán nguyên nhân vô sinh nam nhưng Nhiều nghiên cứu chỉ ra bất thường ADN không đánh giá được hết khả năng sinh tinh trùng gặp nhiều hơn ở nam giới vô sinh sản của nam giới. Trong quá trình sinh tinh, và liên quan đến sảy thai tự phát cũng như đóng gói hay cô đặc NST tinh trùng nhằm thất bại trong hỗ trợ sinh sản. * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thanh Hoa (thanhhoa.mophoi@gmail.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017 87
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Các phương pháp đánh giá bất thường 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. về ADN như SCSA (Sperm chromatin Nghiên cứu mô tả cắt ngang. structure assay), TUNEL (Terminal * Kỹ thuật: deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labling), phương pháp phân tích sao - Lấy mẫu: mẫu tinh dịch được bệnh chổi (Comet assay) hay các dấu ấn sinh nhân (BN) tự lấy bằng phương pháp thủ học... trang thiết bị phức tạp, chi phí cao, dâm, đựng trong cốc chuyên dụng không khó áp dụng rộng r i trong điều kiện độc với tinh trùng. Sau lấy, để trong tủ ấm Việt Nam hiện nay. Trong khi đó, nhuộm 37°C đợi tinh dịch ly giải hoàn toàn. AB là phương pháp có thể đánh giá được - Đánh giá chất lượng tinh dịch trước mức độ hoàn thiện trong khâu đóng gói nhuộm. Lựa chọn các mẫu chất lượng bình ADN tinh trùng, dễ thực hiện, giá thành rẻ. Nguyên lý của phương pháp này dựa thường theo tiêu chuẩn WHO (2010). trên việc AB phản ứng với lysine nên có - Đánh giá bất thường về hình thái thể phân biệt được sự khác biệt trong theo từng đặc điểm: nhuộm lam hình thái thành phần protein nhân cơ bản của tinh theo quy trình thường quy. Đánh giá hình trùng. Nhân tinh trùng chưa trưởng thành thái của 200 tinh trùng dưới vật kính dầu hay bất thường về cô đặc NST rất giàu độ phóng đại x 1.000 lần. Tính tỷ lệ % từng histon chứa hàm lượng lysine phong phú loại bất thường, gồm bất thường đầu, nên bắt màu thuốc nhuộm xanh da trời. Ngược lại, nhân tinh trùng trưởng thành bất thường cổ, bất thường đuôi và bất giàu protaime có hàm lượng lysine rất thường chung. thấp không bắt màu AB. - Đánh giá bất thường cô đặc NST của Trên thế giới, các nghiên cứu vẫn còn tinh trùng bằng AB: nhỏ 10 μl mẫu tinh nhiều tranh cãi về tương quan giữa tỷ lệ dịch lên lam kính, dùng lam khác kéo làm tinh trùng bất thường ngưng tụ NST và lam đàn; để khô trong nhiệt độ phòng; cố các thông số khác của tinh dịch đồ [2, 3]. định bằng nhỏ PFA 4% trong 30 phút; rửa Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào ứng bằng PBS 0,1 M x 2 lần. Nhỏ 10 μl AB 5% dụng phương pháp này. Do đó, chúng tôi trong dung dịch axít acetic 4% (pH 3.5) tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Thử nghiệm nhuộm AB và bước đầu đánh giá phủ kín lam đàn. Để trong vòng 5 phút; mối liên quan giữa bất thường cô đặc NST rửa sạch bằng PBS 0,1 M x 2 lần; để khô của tinh trùng bằng nhuộm AB và hình thái ở nhiệt độ phòng. tinh trùng. - Đánh giá bất thường cô đặc NST tinh trùng bằng kính hiển vi quang học, đếm ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 200 tinh trùng sử dụng vật kính dầu độ phóng đại x 1.000 lần: 1. Đối tƣợng nghiên cứu. 40 mẫu tinh dịch có chất lượng bình + Tinh trùng chưa trưởng thành có phần thường theo tiêu chuẩn WHO (2010). đầu bắt màu xanh đậm của AB. 88
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 + Tinh trùng bán trưởng thành có phần Bảng 1: Đặc điểm chung vi thể tinh dịch đầu vẫn bắt màu thuốc nhuộm chiếm < 50% đồ nghiên cứu. diện tích đầu. Giá trị Giá trị Trung bình + Tinh trùng trưởng thành đầu không Đặc điểm lớn nhỏ (X± SD) bắt màu. nhất nhất * Chỉ tiêu nghiên cứu: Mật độ (triệu/ml) 210 20 72,18 ± 36,42 - Tỷ lệ tinh trùng bất thường đầu. Di động - Tỷ lệ tinh trùng bất thường cổ. PR (%) 84 38 58,68 ± 10,70 - Tỷ lệ tinh trùng bất thường đuôi. PR + NP (%) 85 42 66,90 ± 10,39 Hình thái bình - Tỷ lệ tinh trùng bất thường chung. 18 4 10,30 ± 4,21 thường (%) - Tỷ lệ tinh trùng bất thường cô đặc. Nhóm nghiên cứu có chất lượng vi thể tinh dịch đồ trong giới hạn bình thường. NST = Bảng 2: Đặc điểm hình thái bất thường. * Thời gian và địa điểm nghiên cứu: Giá trị Giá trị Đặc điểm bất Trung nh ớn nhỏ từ tháng 10 - 2016 đến 4 - 2017 tại Trung thƣờng (%) ( ± SD) nhất nhất tâm Hỗ trợ Sinh sản và Công nghệ Mô ghép, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Bất thường đầu 91 77 83,88 ± 4,13 * Phân tích và xử lý số liệu: Bất thường cổ 49 12 30,28 ± 8,61 - Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS Bất thường đuôi 21 2 6,75 ± 3,97 16.0. Bất thường chung 96 82 89,25 ± 4,05 - Kiểm tra mối tương quan bằng hàm Scatter. Xét mối tương quan: |R| < 0,3: Trong các dạng bất thường, bất thường không có mối tương quan; 0,3 < |R| < 0,5: đầu gặp tỷ lệ nhiều nhất, tiếp đến là bất mối tương quan lỏng lẻo; 0,5 < |R| < 0,7: thường cổ, bất thường đuôi ít gặp nhất. mối tương quan trung bình; |R| > 0,7: mối Bảng 3: Đặc điểm về bất thường cô đặc tương quan chặt chẽ. NST sau nhuộm AB. * Đạo đức nghiên cứu: Giá Giá - Nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng Đặc điểm trị trị Trung nh chăm sóc sức khỏe BN. cô đặc NST (%) ớn nhỏ ( ± SD) nhất nhất - Mẫu sau nghiên cứu sẽ được hủy bỏ. Tinh trùng bất thường 29 4 16,25 ± 5,83 Chưa trưởng thành 20 1 8,20 ± 4,84 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bán trưởng thành 15 3 8,05 ± 2,98 1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu nhuộm Tinh trùng bình thường 96 71 83,75 ± 5,83 AB. Nghiên cứu sử dụng 40 mẫu tinh dịch Dưới đây là một số hình ảnh nhuộm bình thường theo tiêu chuẩn WHO (2010). mức độ trưởng thành tinh trùng bằng AB. 89
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Hình 1: Mức độ trưởng thành của tinh trùng (nhuộm AB; x400). (1. Tinh trùng trưởng thành; 2. Tinh trùng bán trưởng thành; 3. Tinh trùng chưa trưởng thành) 2. Mối liên quan giữa bất thƣờng hình thái và bất thƣờng cô đặc NST. Biểu đồ 1: Mối tương quan giữa bất thường hình thái đầu tinh trùng và bất thường cô đặc NST. Có mối tương quan thuận lỏng lẻo giữa tinh trùng bất thường đầu với bất thường cô đặc NST (R = 0,330). Biểu đồ 2: Mối tương quan giữa tinh trùng bất thường cổ và bất thường cô đặc NST. Không có mối tương quan giữa tinh trùng bất thường cổ với bất thường cô đặc NST (R = 0,257 < 0,3). 90
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Biểu đồ 3: Mối liên quan giữa tinh trùng bất thường đuôi và bất thường cô đặc NST. Không có mối tương quan giữa tinh trùng bất thường đuôi và bất thường cô đặc NST (R = 0,03 < 0,3). Biểu đồ 4: Mối tương quan giữa tinh trùng bất thường chung và bất thường cô đặc NST. Có mối tương quan thuận lỏng lẻo giữa bất thường hình thái tinh trùng mức độ vi thể và bất thường cô đặc NST (R = 0,430). BÀN LUẬN Phương pháp này có ưu điểm dễ thực hiện, giá thành rẻ, nhanh chóng và kỹ thuật 1. Phƣơng pháp đánh giá ất thƣờng tương đối đơn giản so với các kỹ thuật cô đặc NST của tinh trùng ằng nhuộm đánh giá độ trưởng thành của tinh trùng AB. khác như sử dụng các chất đánh dấu sinh Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử học của tinh trùng trưởng thành (creatine dụng phương pháp nhuộm AB để kiểm kinase, heat shock protein HspA2 chaperone tra bất thường cô đặc NST của tinh trùng. và hyaluronic axít). 91
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Tuy nhiên, tiêu bản nhuộm màu AB có thái tăng, tỷ lệ bất thường cô đặc NST nhược điểm khó quan sát do tinh trùng cũng tăng. Nhiều tác giả cũng chỉ ra mối bình thường về ngưng tụ NST không bắt tương quan giữa tỷ lệ tinh trùng chưa màu thuốc nhuộm. Một số nghiên cứu trưởng thành hay bất thường cô đặc NST cũng đ thử nghiệm phối hợp AB với các và tỷ lệ tinh trùng dị dạng nói chung và dị loại thuốc nhuộm khác như rose bengal, dạng đầu nói riêng [6, 7, 8]. Nguyên nhân janus green, eosin Y và đưa ra kết luận có thể do thiếu hụt protamine liên quan kết hợp nhuộm AB với nhuộm eosin Y sẽ tới sự toàn vẹn ADN. Có mối liên quan quan sát tinh trùng được r ràng nhất [4]. chặt chẽ giữa quá trình biến đổi tạo túi Vì vậy, để cải tiến kỹ thuật, chúng tôi đề cực đầu trong quá trình sinh tinh với quá xuất có thể phối hợp nhuộm AB với eosin trình cô đặc NST. Đồng thời, sai sót trong để tiêu bản quan sát dễ dàng hơn. quá trình ngưng tụ NST tinh trùng dẫn 2. Mối tƣơng quan giữa ất thƣờng đến suy yếu liên kết gắn acrosome với ngƣng tụ NST và h nh thái tinh trùng. nhân cô đặc cũng gây ra những khiếm Theo khuyến cáo của nhiều nghiên cứu, khuyết ở acrosome. Vì lý do này mà ít nên lấy mốc có tỷ lệ tinh trùng bắt màu nhiều dị dạng đầu tinh trùng có liên quan thuốc nhuộm AB < 20%, coi như mẫu tinh đến bất thường ngưng tụ nhân tinh trùng. dịch có độ trưởng thành của tinh trùng Nhưng vì bất thường đầu tinh trùng còn trong giới hạn bình thường [5]. Tuy nhiên, gồm nhiều dạng bất thường khác không để đảm bảo không bỏ sót mối tương quan chỉ về nhân, hơn nữa nhiều tinh trùng có có thể có giữa các thông số về hình thái hình thái vi thể bình thường, nhưng lại có và độ trưởng thành của tinh trùng, chúng bất thường trong cô đặc NST, do đó mối tôi không chia nhóm mà xét mức độ tương tương quan chúng tôi tìm được là lỏng lẻo, quan giữa các chỉ số hình thái và bất hệ số tương quan với hình thái bất thường thường cô đặc NST. nói chung là 0,430 và với hình thái đầu Theo kết quả nghiên cứu, không có nói riêng là 0,330. mối tương quan giữa bất thường về độ Như vậy, có thể nhận thấy ý nghĩa của trưởng thành của tinh trùng với tỷ lệ bất kết quả phương pháp nhuộm AB đánh giá thường về hình thái của cổ và đuôi tinh mức độ cô đặc NST tinh trùng tương đối trùng. Sự biến đổi của cổ và đuôi tinh độc lập với hình thái tinh trùng. Nhiều nghiên trùng song song và độc lập với quá trình cứu cũng chỉ ra những khiếm khuyết trong biến đổi đầu tinh trùng nên không quan đóng gói nhân tinh trùng có liên quan đến sát thấy mối liên quan giữa bất thường trường hợp sảy thai nguyên phát không rõ cổ và đuôi tinh trùng với bất thường cô nguyên nhân, cũng như tỷ lệ thành công đặc NST. của hỗ trợ sinh sản [9]. Do đó, có thể xem Chúng tôi quan sát thấy có mối tương xét nghiệm đánh giá bất thường về cô đặc quan thuận giữa tỷ lệ tinh trùng bất thường NST như một xét nghiệm độc lập, bổ sung về hình thái đầu và bất thường hình thái chẩn đoán nguyên nhân vô sinh nam, nói chung với tỷ lệ tinh trùng bất thường cũng như những thất bại trong lĩnh vực cô đặc NST, nghĩa là tỷ lệ bất thường hình sinh sản nói chung. 92
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 KẾT LUẬN 4. Park Y.S, Kim M.K, Lee S.H et al. Addition of eosin to the aniline blue assay to Nhuộm AB là phương pháp đơn giản enhance detection of immature sperm histones. giúp đánh giá mức độ cô đặc NST tinh Fertil Steril. 2011, 90 (5), pp.1999-2002. trùng. Do mối tương quan giữa bất thường 5. Esterhuizen A.D, Franken D.R, Lourens cô đặc NST với các dạng bất thường hình J.G et al. Sperm chromatin parkaging as an thái là lỏng lẻo, hay không có tương quan indicator of in-vitro fertilization rates. Hum Reprod. nên có thể sử dụng phương pháp này như 2000, 15 (3), pp.657-661. một xét nghiệm độc lập đánh giá chất lượng 6. Zini A, Phillip S, Courchesne A et al. tinh dịch. Sperm head morphology is related to high deoxyribonucleic acid stainability assessed by sperm chromatin structure assay. Fertil Steril. TÀI LIỆU THAM KHẢO 2009, 91 (6), pp.2495-2500. 1. Lewis J.D, Abbott D.W. Ausio J. A haploid 7. Boitrelle F, Ferfouri F, Petit J.M et al. affair: core histone transitions during Large human sperm vacuoles observed in motile spermatogenesis. Biochem Cell Biol. 2003, spermatozoa under high magnification: nuclear 81 (3), pp.131-140. thumbprints linked to failure of chromatin 2. Hammadeh M.E, Zeginiadov T, Rosenbaum condensation. Hum Reprod. 2011, 26 (7), P et al. Predictive value of sperm chromatin pp.1650-1658. condensation (aniline blue staining) in the 8. Sellami A et al. Assessment of chromatin assessment of male fertility. Archives of maturity in human spermatozoa: useful aniline Andrology. 2001, 46 (2), pp.99-104. blue assay for routine diagnosis of male infertility. 3. Hekmatdoost A, Lakpour N, Sadeghi Adv Urol. 2013, pp.578-631. M.R. Sperm chromatin integrity: etiologies and 9. Talebi A.R, Vahidi S, Aflatoonian A et al. mechanisms of abnormality, assays, clinical Cytochemical evaluation of sperm chromatin importance, preventing and repairing damage. and DNA integrity in couples with unexplained Avicenna J Med Biotechnol. 2009, 1 (3), recurrent spontaneous abortions. Andrologia. pp.147-160. 2012, 44 (1), pp.462-470. 93