Đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể y ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng và ít tinh trùng

Nội dung text: Đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể y ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng và ít tinh trùng

1. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 ĐẶC ĐIỂM VÀ PHÂN BỐ MẤT ĐOẠN NHỎ NHIỄM SẮC THỂ Y Ở BỆNH NHÂN VÔ SINH NAM KHÔNG CÓ TINH TRÙNG VÀ ÍT TINH TRÙNG TrÇn Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang*; Quản Hoàng Lâm* Ngô Trường Giang*; Nguyễn Thị Việt Hà* TÓM TẮT Phân tích mất đoạn gen của vùng yếu tố vô tinh trùng (TT) của nhiễm sắc thể (NST) Y bằng phương pháp PCR là một công cụ sàng lọc quan trọng trong điều trị vô sinh nam. Nghiên cứu sử dụng phương pháp multiplex PCR để phân tích mất đoạn nhỏ NST Y sử dụng 19 trình tự mồi phát hiện (STSs) thuộc ba gen của vùng yếu tố vô TT hoÆc Ýt TT. 323 bệnh nhân (BN) đối tượng nam không có TT có NST bình thường được phân tích. Kết quả: phát hiện 17/323 nam giới vô sinh (5,26%) bị mất đoạn nhỏ NST Y. Trong đó, 3 BN mất đoạn AZFa, 1 BN mất đoạn AZFb, 11 BN mất đoạn AZFc+d, 1 BN mất đoạn AZFa+b+c và 1 BN mất đoạn AZFa+b+c+d. Hai tổ hợp multiplex PCR được thiết kế sử dụng 8 trình tự mồi (STSs) có thể phát hiện một cách hiệu quả các mất đoạn phổ biến trên NST Y ở đối tượng vô sinh nam. * Từ khoá: Vô sinh nam; Vô tinh trùng; Mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y. CHARACTERISTICS AND DISTRIBUTION OF MICRODELETIONS ON Y CHROMOSOME in infertile azoospermia men Summary Analysis of the microdelection in azoospermia factor (AZF) region of Y chromosome by PCR is an important screening tool in treatment of infertile males. In the present study, the Y chromosome microdeletions were analyzed by PCR, using primers corresponding to 19 sequence tagged sites (STSs) on three genes of the AZF region. A total of 323 azoospermic male showing normal karyotype were included in the study. Results: Y chromosome microdeletions were observed in 17 out of 323 (5.26%) infertile males. Of the seventeen subjects, 3 had deletions in AZFa, 1 in AZFb, 11 in AZFc+d, 1 in AZFa+b+c regions and 1 in AZFa+b+c+d. Two multiplex PCRs were designed using 8 STSs markers, which could detect efficiently almost Y chromosome microdeletions in infertile males. * Key words: Male infertile; Azoospermia; Micro-deletions in the Y-chromosome. ĐẶT VẤN ĐỀ 10 - 15%. Khoảng 10% trường hợp vô sinh không có TT không rõ nguyên nhân. Phân Tỷ lệ vô sinh chiếm khoảng 5 - 10% các tích di truyền cho thấy 3 vùng không chồng cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản. Khoảng nhau trên NST Y gọi là vùng yếu tố vô TT 40% do nam giới, 40% do nữ và 20% còn AZFa, AZFb và AZFc [10]. Mất đoạn nhỏ một lại do cả hai [3]. Trong số các trường hợp vô trong số các gen này có thể liên quan đến sinh nam, tỷ lệ không có TT chiếm khoảng suy giảm sinh tinh và vô sinh nam [1, 4, 6, 8]. * Học viện Quân y Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Hoàng Văn Lương GS. TS. Nguyễn Đình Tảo 1
2. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 Những nghiên cứu tần số mất đoạn nhỏ * Tách AND: NST Y ở các chủng tộc trên thế giới cho Sử dụng kit ADN Blood Minikit (Qiagen) thấy kết quả mất đoạn nhỏ NST Y ở nam để tách ADN theo quy trình hướng dẫn của giới không TT và ít TT không rõ nguyên nhà sản suất. Kiểm tra nồng độ, độ tinh nhân dao động từ 1 - 55%. Tuy nhiên, chưa sạch mẫu ADN thu được bằng hệ thống có nhiều nghiên cứu về mất đoạn nhỏ NST Nano-Drop 1000, USA. Kiểm tra các mẫu Y trên BN vô sinh nam ở Việt Nam. Nghiên đạt nồng độ, độ tinh sạch sẽ được dùng cứu này được thực hiện nhằm: Phân tích cho phản ứng PCR. đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ NST Y * Lựa chọn các cặp mồi nhân đoạn gen ở BN nam không có TT. AZF: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP - Tiêu chí lựa chọn: mồi nhân trình tự NGHIÊN CỨU đặc hiệu trên vùng AZF thuộc nhánh dài NST Y. Mỗi vùng AZF a, b, c có ít nhất hai 1. Đối tƣợng nghiên cứu. trình tự mồi, đặc biệt các vị trí hay xảy ra 323 nam giới vô sinh, không TT hoÆc Ýt đứt gãy, mất đoạn gen. Các mồi có nhiệt độ TT, có vợ bình thường, đến khám tại Trung gắn mồi tương đương nhau. Chúng tôi lựa tâm Công nghệ Phôi, Học viện Quân y, Bộ chọn được 19 cặp mồi nhân vùng gen AZZF môn Y sinh học - Di truyền, Đại học Y Hà và 1 cặp mồi SRY nhân đoạn gen trên nhánh Nội và Viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội ngắn NST Y làm nội chứng dương. trong thời gian 2010 - 2011. Sau khám xét * Multiplex PCR: lâm sàng, xét nghiệm hormon và kiểm tra Dựa vào kích thước sản phẩm PCR, hệ thống sinh dục, lựa chọn nam vô sinh chúng tôi tổ hợp các mồi trên vào 5 ống không có TT làm đối tượng nghiên cứu. Lấy phản ứng để chạy multiplex PCR. Mỗi phản tinh dịch xét nghiệm sau khi kiêng sinh hoạt ứng bao gồm 9 μl mastermix, 2 - 3 μl ADN tình dục trong vòng 7 ngày. Phân tích các khuôn, 0,25 - 0,5 μl mỗi mồi, nước cất vừa mẫu tinh dịch theo tiêu chí của Tổ chức Y tế đủ đến 15 μl. Phản ứng thực hiện qua 35 Thế giới. chu kỳ. Chu trình nhiệt cho mỗi chu kỳ như * Tiêu chí loại trừ: vô sinh thứ phát, có bất 0 0 sau: 94 C trong 45 giây, 57 C trong 45 giây thường cơ quan sinh dục, bất thường NST. và 720C trong 1 phút. Chương trình được đặt 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. biến tính lần đầu trước ở 940C trong 11 phút Mô tả cắt ngang. và cuối cùng nối dài 720C trong 6 phút. SRY (472 bp) SRY (472 bp) SRY (472 bp) DBY (689 bp) SRY (472 bp) sY254 (350 bp) sY84 (326 bp) sY143 (311 bp) SRY (472 bp) USP9Y (249 bp) sY86 (320 bp) sY134 (301 bp) sY128 (228 bp) sY157 (285 bp) sY81 (209 bp) sY127 (274 bp) sY153 (139 bp) sY130 (173 bp) AZFa (220 bp) sY133 (177 bp) sY124 (109 bp) sY121 (190 bp) sY255 (126 bp) sY152 (125 bp) * Điện di: 2
3. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, trong 1 giờ với hiệu điện thế 100 V và cường độ dòng điện 100 mA, nhuộm ethidium bromide, soi UV, chụp hình và phân tích. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Sử dụng phản ứng multiplex PCR khảo sát mất đoạn nhỏ NST Y vùng AZF trên 329 BN vô sinh nam không có TT, kết quả như sau: 1. Tỷ lệ mất đoạn vùng AZF ở BN vô sinh nam. Với 323 BN vô sinh nam được kiểm tra không có bất thường về kiểu nhân, tiến hành phân tích ADN, chạy multiplex PCR với 19 cặp mồi nêu trên. Kết quả cho thấy: trong tổng số 323 BN được xét nghiệm ADN, 17 BN (5,26%) bị mất đoạn trên vùng AZF. Đối chiếu với kết quả của một số tác giả khác trong khu vực và trên thế giới chúng tôi thấy: Bảng 1: Tỷ lệ mất đoạn của nghiên cứu này so với một số nghiên cứu khác. TÁC GIẢ n SỐ STSs TỶ LỆ (%) Martinez M.C, 2000 (Tây Ban Nha) [6] 57 10 14 Canan F, 2004 (Thổ Nhĩ Kỳ) [3] 47 6 4,26 A Zhou Can, 2006 (Trung Quốc) [2] 220 6 15 Anurag Mitra, 2008 (Ấn Độ) [1] 170 6 5,29 Nghiên cứu này 323 20 5,26 Tỷ lệ mất đoạn NST dao động trong các nghiên cứu khác nhau. Tuy nhiên, tỷ lệ này trong nghiên cứu của chúng tôi nằm ở giá trị trung bình so với các nghiên cứu khác của các nước trong cùng khu vực cũng như châu Âu, cho thấy việc lựa chọn cặp mồi để phát hiện mất đoạn nhỏ phù hợp với đối tượng nam vô sinh không TT ở người Việt Nam. 2. Phân bố mất đoạn theo từng vùng AZFa, AZFb, AZFc. Bảng 2: Phân bố tỷ lệ mất đoạn trên từng vùng AZF của nghiên cứu này và một số nghiên cứu khác. MATINEZ CANAN F. A ZHOU CAN ANURAG NGHIÊN PHÂN BỐ (TÂY BAN THỔ NHĨ (TRUNG (ẤN ĐỘ) [1] CỨU NÀY NHA) [6] KỲ [3] QUỐC) [2] Mất đoạn vùng AZFa 3 (17,65%) 0 0 5 2 Mất đoạn vùng AZFb 1 (5,88%) 1 1 8 1 Mất đoạn vùng AZFc 0 3 0 19 3 Mất đoạn vùng AZFd 0 - - 0 - (1) (2) (3) (4) 5) (6) 3
4. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 Mất đoạn vùng AZFa+b 0 0 0 0 0 Mất đoạn vùng AZFb+c 0 4 1 0 3 Mất đoạn vùng AZFc+d 11 (64,71%) - - 1 - Mất đoạn vùng AZFa+b+c 1 (5,88%) 0 - 0 - Mất đoạn vùng AZFa+b+c+d 1 (5,88%) - - 0 - Tổng số 17/323 8/57 2/47 33/220 9/170 Mất đoạn AZFc+d thường đi cùng nhau 6 BN có hai mất đoạn và 3 BN mất ba đoạn. và chiếm tỷ lệ cao nhất. Điều này có thể lý Những mất đoạn chủ yếu ở vùng AZFc giải vì vùng AZFd là vùng chồng lấn AZFb (21/17 BN). Nghiên cứu của chúng tôi: điểm và c, do đó, một số tác giả gộp vùng AZFb tương đồng về tỷ lệ mất đoạn AZFc+d là chủ với c thành một vùng AZFc. Chỉ 2 BN mất yếu [1, 2, 3]. Tuy nhiên, tỷ lệ mất đoạn AZFa đoạn trên cả 3 vùng AZFa+b+c hoặc 4 vïng trong nghiên cứu này cao hơn các nghiên AZFa+b+c+d. cứu khác là do đối tượng tham gia nghiên Mir Davood Omrami và CS [7] nghiên cứu chưa đại diện tiêu biểu cho cộng đồng cứu, trên 99 BN không có TT và ít TT sử dân cư trên toàn quốc, thông thường, các dụng 20 cặp mồi khác nhau bằng kỹ thuật trường hợp đến khám và điều trị tại các trung multiplex PCR đã phát hiện 17 BN mất đoạn tâm đã từng khám và điều trị ở nhiều nơi gen. Trong đó, 15 BN có một mất đoạn, khác nhưng không đạt kết quả mong muốn. 3. Phân bố mất đoạn theo từng STS. Bảng 3: Phân bố tỷ lệ BN vô sinh nam theo từng STS nghiên cứu. a b d c UPSP9Y AZFa DBY 121 124 127 128 130 133 134 143 152 153 254 255 157 sY 81 84 86 Tổng 0 0 3 1 0 0 2 0 2 0 2 1 1 0 15 14 14 14 14 (n = 83) Thống kê theo từng STS nghiên cứu ở A Zhou-Cun [2] nghiên cứu trên 358 từng vùng AZF thấy: các mất đoạn ở sY152, trường hợp, trong đó, 256 BN không TT và sY153, sY254, sY255, sY157 chiếm tỷ lệ 102 BN ít TT phát hiện 319 BN không có cao nhất, 71/83 BN mất đoạn các loại, tiếp bất thường nhiễm sắc, 220 BN không TT và đến là mất đoạn ở sY84, sY127, sY121, 99 BN ít TT, sử dụng 12 cặp mồi sàng lọc sY130, sY133, s134, còn lại không phát mất đoạn nhỏ NST Y, 46 BN (14,4%) có mất hiện thấy mất đoạn ở các sY khác. đoạn. 33/220 BN không TT (15%) mất đoạn. Trong đó, tỷ lệ mất đoạn cao nhất liên quan 4
5. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 đến các sY: 152/254/255 (20/33 BN). Tiếp quan đến tiên lượng và chỉ định điều trị. theo, sY84 (127/134 BN), sY86 chỉ gặp 1 BN. Giữa tỷ lệ mất đoạn nhỏ được phát hiện và Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ STS được sử dụng trong nghiên cứu có mất đoạn AZFc liên quan đến các sY: mối quan hệ chặt chẽ với nhau. Vì vậy, 152/153/254/255/157 là cao nhất. Canan nghiên cứu thêm để đưa ra bộ STS phù Figen Sargın và CS (2004) [3], nghiên cứu hợp nhằm có được kết quả cao là điều cần trên 60 BN, 48 BN không TT, 13 BN ít TT, thiết [9]. phát hiện thấy 3 BN (3,3%) có mất đoạn. Dưới đây là một số kết quả điện di trong Trong đó, 1 BN mất đoạn liên quan sY127/254 nghiên cứu: và 1 sY84/134 và 1 sY86. Nhiều nghiên cứu cũng thấy mất đoạn hoàn toàn vùng AZFa chắc chắn sẽ dẫn tới hội chứng SCOS [1, 4, 6, 8]. Ở những BN này, việc chọc hút hay sinh thiết mào tinh để lấy TT hoàn toàn vô ích. Do vậy, nên khuyên những BN này nhận con nuôi thay vì theo đuổi các phương pháp điều trị. Đối với trường hợp chỉ mất đoạn vùng AZFb sẽ gây hiện tượng kìm hãm quá trình sinh tinh, trường hợp BN mất đoạn AZFb+c dẫn tới hội chứng SCOS hoặc hiện tượng kìm hãm sinh tinh [4]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, 1 trường Hình 1: Ảnh điện di của BN phát hiện hợp mất cả hai STS sY127, sY134 của mất đoạn ở sY84, sY86. vùng AZFb. Đối với BN bị mất AZFb hoặc AZFb/c không thấy TT khi áp dụng kỹ thuật TESE. Hopp và CS [4] đã chứng minh, đối với những mất đoạn trên AZFa, AZFb, AZFb+c, không có khả năng tách TT khi sử dụng kỹ thuật TESE, trong khi đó, đối với mất đoạn trên AZFc, khả năng tách TT từ tinh hoàn thành công lên đến 75%. Tương đồng với những kết quả nghiên cứu trên, Krausz [5] đã phát hiện 50% xuất hiện TT ở trường hợp mất đoạn thuộc vùng AZFc và những mất đoạn thuộc vùng AZFa, AZFb hiếm khi tách được TT từ tinh hoàn. Vì vậy, phát hiện các mất đoạn AZF khác nhau liên 5
6. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 Hình 2: Ảnh điện di của BN phát hiện Từ kết quả trên, cùng với đặc điểm phân mất đoạn ở sY127 và sY134. bố STS trên vùng AZF, chúng tôi lựa chọn 8 trình tự mồi có khả năng phát hiện các mất đoạn nhỏ trên NST Y thường gặp trong hai tổ hợp multiplex PCR (hình 5). Hình 5: Hai tổ hợp multiplex PCR. Hình 3: Ảnh điện di của BN phát hiện Ống 1: 1: Marker 100 bp, 2: Multiplex 1; mất đoạn ở sY84, sY134 và sY153. 3-8: PCR đơn mồi: sY134 (301bp), sY84 (326bp), sY254 (350bp), SRY (472bp), DBY (689bp) và chứng âm. Ống 2: 1: Marker 100bp, 2: Multiplex 2, 3-8: PCR đơn mồi: sY255 (126bp), USP9Y (249bp), sY127 (274bp), sY86 (320bp), SRY (472bp) và chứng âm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anurag M. Rima D. Rajeev K, et al. Screening for Y-chromosome microdeletions in infertile Idian males: utility of simplified multiplex PCR. Indian J Med Res 127. 2008, pp.124-132. 2. A Zhou-Cun, Yang Yuan, Zhang Si-Zhong, Zhang Wei, Lin Li. Chromosomal abnormality and Y chromosome microdeletion in Chinese patients with azoospermia or severe oligozoo- Hình 4: Ảnh điện di của BN phát hiện spermia. Acta Genetica Sinica. 2006, February, mất đoạn ở sY254 và sY153. 33 (2) I 1, pp.1-116. 3. Canan Figen Sargın, et al. AZF microdeletions BN bước đầu phát hiện thấy bị mất đoạn on the Y chromosome of infertile men from Turkey. ở STS sẽ được tiến hành kiểm tra lại bằng Annales De Génétique. 2004, 47, pp.61-68. PCR đơn mồi. 4. Hopps C.V, Mielnik A, Goldstein M, Palermo G. D, Rosenwaks Z and Schlegel P N. 6
7. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 Detection of sperm in men with Y chromosome 8. Peterlin B, Kunej T, Sinkovec J et al. microdeletions of the AZFa, AZFb and AZFc Screening for Y chromosome microdeletions in regions. Human Reproduction. 2003, Vol 18, 226 Slovenian sub-fertile men. Hum Reprod. No 8, pp.1660-1665. 2002, 17, p.17. 5. Krausz C, McElreavey K. Y chromosome 9. Simoni M, Bakker E and Krausz C. and male infertility. Frontiers in Bioscience. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular 1999, 4, pp.1-8. diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. State 6. Marti’nez M. C et al. Screening for AZF of Art 2004. International Journal of Andrology. deletion in a large series of severely impaired 2004, 27, pp.240-249. spermatogenesis patients. Journal of Andrology. 10. Vogt PH, Edelmann A, Kirsch S et al. 2000, September/October, Vol 21, No 5, Human Y chromosome azoospermia factors pp.651-655. (AZF) mapped to different subregions in Yq11. 7. Mir Davood Omrani, Saied Samadzadae, Hum Mol Genet. 1996, 5, pp.933-943. Mortaza Bagheri, Kiarash Attar. Y chromosome microdeletions in idiopathic infertile men from West Azerbaijan. Urology Journal UNRC/IUA. 2006, Vol 3, No 1, pp.38-43. Ngµy nhËn bµi: 1/10/2012 Ngµy giao ph¶n biÖn: 28/11/2012 Ngµy giao b¶n th¶o in: 28/12/2012 7
8. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 8