Đặc điểm phân bố các subtýp HIV - 1 tại Việt Nam

Nội dung text: Đặc điểm phân bố các subtýp HIV - 1 tại Việt Nam

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 ĐẶC ĐIỂM PHÂN BỐ CÁC SUBTÝP HIV-1 TẠI VIỆT NAM Phạm Đức Minh*; Đặng Xuân Kiên*; Trần Văn Tuấn* TrÇn ThÞ Oanh**; Lê Bách Quang* TÓM TẮT Nghiên cứu xác định các subtýp HIV-1 bằng PCR đa mồi và giải trình tự của 720 mẫu trên các khu vực nghiên cứu, xác định đƣợc subtýp của 679 mẫu, trong đó, chủ yếu là subtýp CRF01-AE (98,53%), subtýp B (1,33%), subtýp CRF25_CPX (0,15%). Không xác định đƣợc subtýp của 41 mẫu (5,69%). Sử dụng phƣơng pháp PCR đa mồi đã tối ƣu nhằm xác định các subtýp HIV-1 tại Việt Nam có giá trị tƣơng đƣơng với phƣơng pháp giải trình tự. * Từ khóa: HIV-1; Phƣơng pháp PCR đa mồi; Subtýp HIV; Ph©n bè. CHARACTERISTICS OF DISTRIBUTION OF SUBTyPe HIV-1 IN VIETNAM Summary The study identified the HIV-1 subtypes by mPCR and sequencing of 720 samples in the study area, the results showed the subtype of the 679 samples, which mainly subtype CRF01-AE (98.53%), subtype B (1.33%), subtype CRF25_CPX (0.15%). The subtype of 41 samples (5.69%) can not be identified. Optimal mPCR methods was used for identification of HIV-1 subtype in Vietnam which is equivalent to the sequencing method. * Key words: HIV-1; mPCR; HIV subtype; Distribution. ĐẶT VẤN ĐỀ trội theo đƣờng lây truyền nhất định. Ví dụ, HIV có 2 týp là HIV-1 và HIV-2, cả hai ở Thái Lan, phân týp B trội ở những đối týp này đều lây truyền qua đƣờng tình dục, tƣợng tiêm chích ma túy, phân týp E trội ở đƣờng máu và từ mẹ sang con. Riêng HIV- trƣờng hợp lây nhiễm qua đƣờng tình dục 1 có tính đa dạng di truyền cao và dễ dàng [6, 7]. Nghiên cứu sự phân bố các phân týp lây lan nhanh trong cộng đồng. Các chủng và dạng tái tổ hợp của HIV-1 có giá trị trong của HIV-1 đƣợc phân thành 4 nhóm: M, N, giám sát dịch tễ học ở tầm quốc gia và khu O, P, trong đó, nhóm M chiếm đa số, đƣợc vực, góp phần xây dựng chiến lƣợc dự phòng, chia thành 10 phân týp, bao gồm: phân týp phát triển vắcxin thích hợp cho từng khu A, B, C, D, E, F, G, H, J và K và 49 dạng tái vực, đối tƣợng, chế tạo kit chẩn đoán và tổ hợp (CRFs) [7] của các phân týp trên. lựa chọn liệu pháp kháng virut đặc hiệu do Phân týp phân bố mang tính trội cho từng hiệu quả của thuốc kháng virut khác nhau vùng địa lý khác nhau, mỗi phân týp lại có tính với từng phân týp [1, 3, 6]. * Học viện Quân y ** Bộ Y tế Người phản hồi (Corresponding): Phạm Đức Minh dminhphamduc@gmail.com 33
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP sạch ADN bằng bộ kít QIAamp DNA Mini NGHIÊN CỨU Kit (QIAGEN). 1. Đối tƣợng nghiên cứu. Các ADN mồi cho phản ứng mPCR để xác - Đối tƣợng: 720 bệnh nhân (BN) từ các định phân týp HIV (Fumihiro Y [3]), gồm: Trung tâm Phòng chống HIV-AIDS của tỉnh, + BECO5 (7938-7960 bp): 5’ GGCATCA- trại cai nghiện, Trung tâm Giáo dục Lao AACAGCTCCAGGCAAG 3’ động Xã hội (số 02, 05), bệnh viện tỉnh, + BECO3 (8766-8791 bp): 5’AGCAAA- thành phố đang điều trị HIV-1 của Khánh GCCCTTTCTAAGCCCTGTCT3’ Hòa, Đ¾k Lắk, TP. Hồ Chí Minh, Cần Thơ, + BE-ANCH (7963-7985 bp): 5’TCCTGG- Tây Ninh, Đà Nẵng, Hà Nội, Yên Bái, Sơn CTGTGGAAAGATACCTA3’ La, Lạng Sơn, Quảng Ninh và Nghệ An. + B-SPEC (8384-8403 bp): 5’GTCCCC- - Bệnh phẩm: mẫu bệnh phẩm là mẫu TCGGGGCTGGGAGG 3’. máu từ các đối tƣợng nghiên cứu nhƣ trên. + E-SPEC (8585 bp) 5’ GTCTCAG- Chia mỗi mẫu bệnh phẩm để bảo quản theo TCCCTTGAGACTGCTG 3’. máu toàn phần và buffy coat, bảo quản -800C + C-SPEC (8615-8638 bp): 5’ AGACCCC- trong các Eppendorf 1,5 ml vô trùng. AATACTGCACAAGACTT 3’. - Mẫu chứng: những ngƣời không có + F-SPEC (8720-8744 bp): 5’AACAGC- HIV-1 dƣơng tính: 50 BN bị nhiễm HBV TCTACCAGCTCTTTGCAAA 3’. nhƣng không nhiễm HIV-1 làm đối chứng + 5’A (8094-8112 bp):5’ GANAACATGA- (đƣợc xét nghiệm và đang điều trị ngoại trú CCTGGCTGC 3’. tại Bệnh viện 103, Học viện Quân y). 3’A (8693-8716 bp): 5’TCTATAACCC- 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. TATCTGTCCAGCCA 3’. Cắt ngang và phân tích labo để tìm hiểu + 5’E (8181-8207 bp): 5’CAGGAAAGGAA- phân týp HIV-1. TGAAAAGGATTTGTTA 3’. Xác định cỡ mẫu bằng phƣơng pháp 3’E (8693-8713 bp): 5’ATAACCCTATCT- dịch tễ học nghiên cứu tỷ lệ trong quần thể. GTCCACCCC 3’. Mẫu máu đƣợc chống đông, ly tâm tách + 5’G (8131-8757 bp): 5’ACAATTACAC- huyết tƣơng, bảo quản lạnh, vận chuyển về ATACCACATATACAGCC 3’. Trung tâm Nghiên cứu Y - Dƣợc học Quân 3’G (8694-8716 bp): 5’TCTATAACCC- sự, Học viện Quân y. Tách khối bạch cầu, TATCTGTCCAGTT 3’. tách và tinh sạch ADN bằng bộ kít QIAamp + 5’D (8037-8058 bp): 5’ACCACTAAT- DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức). GTGCCCTGGAACT 3’. Sử dụng kỹ thuật mPCR xác định phân 3’D (8356-8386 bp): 5’ AGGAGGGTCT- týp HIV [1, 2, 3]; kiểm chứng phân týp bằng GAAATGACAGA 3’. kỹ thuật giải trình tự, đối chiếu với Genbank * Phƣơng pháp mPCR xác định phân týp [7]. Tiến hành kỹ thuật nghiên cứu tại Trung HIV-1 với ADN mồi khuếch đại vùng gen env tâm Nghiên cứu Y - Dƣợc học Quân sự, (gp120 và gp41) tiến hành theo trình tự sau Học viện Quân y. (cải tiến từ nghiên cứu của Fumihiro [2, 3]): Thu thập mẫu máu của đối tƣợng HIV PCR1 với ADN mồi BECO3 và BECO5 (+), sau đó tách khối bạch cầu, tách và tinh khuếch đại gp120 và gp41. 35
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 PCR2 xác định phân týp A, E, G với các KCl), bổ sung nƣớc tới thể tích 25 µl. Phản ADN mồi (5’A-3’A), (5’E-3’E), (5’G-3’G). PCR2.1 ứng PCR thực hiện trên hệ thống luân xác định phân týp A, E, G, B, D, C, F với ADN nhiệt, với chu trình nhiệt: 5 phút biến tính ở mồi BE-ANCH là mồi xuôi, 4 cặp primer 95 0C, 35 chu kỳ (95oC/45 giây - 64oC/phút - B-SPEC, C-SPEC, E-SPEC và F-SPEC là 72oC/1,5 phút), cuối cùng chu kỳ tổng hợp mồi ngƣợc khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 10 phút ở 72oC. Kiểm tra hiệu quả quá trình cho HIV-1 phân týp A, B, C, D, E, F và G. khuếch đại và kích thƣớc sản phẩm PCR PCR2.2 phân biệt phân týp B, D với ADN trên gel agarose 1% nhuộm bằng ethidium. mồi 5’D -3’D. * Phương pháp giải trình tự: lấy ngẫu - Hỗn hợp mix cho 1 phản ứng PCR nhiên 30% sản phẩm phản ứng PCR của gồm: 200 µM của mỗi loại dNTP; 2,5 mM mẫu nghiên cứu để giải trình trừ xác định MgCl2; 0,2 pmol của mỗi loại ADN mồi; subtýp. 1 U Taq ADN polymerase (Invitrogen) và 1 x đệm PCR (20 mM Tris-HCl, pH 8.4, 50 mM KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. So sánh kết quả của hai phƣơng pháp mPCR và giải trình tự. Bảng 1: Kết quả xác định subtýp bằng 2 phƣơng pháp. MẪU SỐ MẪU MPCR SEQUENCING E B Kh¸c CRF_AE B CPX Cần Thơ 20 20 20 TP. Hồ Chí Minh 48 47 1 47 1 Khánh Hòa 16 16 16 Tây Ninh 20 20 20 Đắk Lắk 20 19 1 19 1 Đà Nẵng 20 19 1 19 1 Hà Nội 40 39 1 38 1 1 Yên Bái 20 19 1 19 1 Sơn La 16 16 16 Lạng Sơn 20 19 1 19 1 Quảng Ninh 32 29 3 29 3 Nghệ An 16 16 16 TỔNG 288 279 9 0 278 9 1 Tiến hành giải trình tự và đối chiếu với phƣơng pháp mPCR cho thấy kết quả của 2 phƣơng pháp tƣơng đƣơng nhau. Riêng trên địa bàn Hà Nội, xuất hiện 1 trƣờng hợp đƣợc xác định subtýp CPX sau khi giải trình tự, trong khi đó, mPCR xác định là subtýp E. 2. Phân bố các subtýp HIV-1. 36
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Bảng 2: Phân bố subtýp HIV-1 theo các khu vực nghiên cứu. SUBTÝP MẪU ÂM TÍNH DƢƠNG TÍNH E-A B CPX Cần Thơ 5 45 45 0 0 TP. Hồ Chí Minh 5 115 114 1 0 Khánh Hòa 2 38 38 0 0 Tây Ninh 6 44 44 0 0 Đắk Lắk 3 47 46 1 0 Đà Nẵng 3 47 46 1 0 Hà Nội 5 95 93 1 1 Yên Bái 2 48 47 1 0 Sơn La 2 38 38 0 0 Lạng Sơn 2 48 47 1 0 Quảng Ninh 4 76 73 3 0 Nghệ An 2 38 38 0 0 TỔNG 41 679 669 9 1 % (n = 679) 100,00 98,53 1,33 0,15 % (n = 720) 5,69 94,31 92,92 1,25 0,14 Trong số các mẫu HIV dƣơng tính đƣợc xác định subtýp, tỷ lệ phổ biến nhất là subtýp CRF_01AE (98,53%), tỷ lệ subtýp B là 1,13%. 01 mẫu CRF25_CPX (0,15%). Sai khác về tỷ lệ giữa các phân nhóm theo khu vực nghiên cứu không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Bảng 3: Phân bố subtýp HIV-1 theo độ tuổi. TUỔI 18 - 29 30 - 39 40 - 49 50 - 59 > 60 TỔNG SUBTÝP n % n % n % n % n % AE 116 17.34 456 68.16 83 12.41 12 1.79 2 0.30 669 B 0 - 7 77.78 2 22.22 0 - 0 - 9 CPX25 1 100.0 0 - 0 - 0 - 0 - 1 Tổng 125 18,41 492 72,46 88 12,96 13 1,91 2 0,29 679 p > 0,05 Subtýp AE và B chủ yếu ở ngƣời trong độ tuổi lao động, đây cũng là độ tuổi nhiễm HIV nhiều nhất tại Việt Nam (p > 0,05). Tuy nhiên, do đây là 2 subtýp xuất hiện chủ yếu trong nghiên cứu nên số liệu chƣa đạt tính đa dạng. 2. Mẫu HIV-1 mang subtýp CRF25_cpx. 37
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Hình 1: Chọn trình tự kiểu gen N77 trên phần mềm Bio edit. Trên kết quả giải trình tự, chọn lọc những phần rõ nét của trình tự để blast với ngân hàng gen thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Trình tự gen chọn lọc: ACTGGGACGGGATGTACAATGTCGCTCATGCATGCCACTGGATTAGCCAGTGGTATCA CTCATTGCTGCTAATGGCAGTCTCGCAAAAAGAATATAATCAATCTGAAACCTCACAGACAT GCCAAATCATAATATGCATCTTAATGAATCTGTAAATCATTGTACCAACCCTACACATAAACA AAATAACTACTATGACCACCACAAAAATCTATATACAAAAAAAGTAGGAGAAATATAAAAAAA CTTTTTGTGTTGATGTGCACCATGTGTGTGTTTTATAAAAGAGCTGTGGACTACAAGACACT TTTTAATATAGTATATCTTTTACCACCCTCTCAGGAGACTCAAATACACACTCATTTTATAGT CACAGGAGATTTCTCTATACACACACACTGTGATGTATAGTGACAATTACACGCGAGAGGG TATATACATACACTCCCCCGGATAAACACTATAACACTGCACAGAGACA Hình 2: Blast kiểu gen N77 trên ngân hàng gen NCBI. Kết quả blast cho thấy: trình tự thu đƣợc thuộc về HIV-1 với xác suất rất cao (E-value: 1e-34). 38
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Hình 3: So trình tự kiểu gen N77 trên genotyping NCBI. So sánh trình tự với genotyping trên ngân hàng gen NCBI thu đƣợc kết quả ở hình 3 là mẫu HIV-1 mang subtýp 25_CPX. BÀN LUẬN thêm số liệu tham khảo nhằm kiểm soát tình hình nhiễm HIV trong nƣớc và khu vực. Trong thời gian gần đây, một số tác giả đã nghiên cứu về sự phân bố các subtýp Kết quả cho thấy: phân týp dạng tái tổ hợp HIV trong khu vực Đông Nam Á. Sa Nguon CRF01-AE của HIV-1 là phân týp chủ yếu Ta Van (2011) đã bƣớc đầu tiến hành nghiên ở cả KVHN (98,57%) và KVVC (84,30%). cứu trên 280 BN có HIV (+), bao gåm 140 BN Viêng Chăn có tỷ lệ phân týp HIV phức tạp ở khu vực Hà Nội (KVHN) và 140 BN ở khu và đa dạng hơn Hà Nội. Ngoài dạng CRF01- vực Viêng Chăn (KVVC). Tác giả đã tập trung AE, phát hiện cả phân týp A, B, C với tỷ lệ xác định và so sánh phân týp HIV-1 trên các đối tƣợng có xét nghiệm HIV dƣơng tính thấp. Trong các nhóm đối tƣợng nghiên cứu, ở KVHN và KVVC; tìm hiểu sự tƣơng đồng tiêm chích ma túy và gái mại dâm có tỷ lệ của các phân týp HIV, làm tiền đề cho những phân týp phức tạp hơn các đối tƣợng khác nghiên cứu tiếp theo, góp phần thiết kế bản [6]. đồ dịch tế học phân týp HIV-1 tại Việt Nam, Những nghiên cứu ban đầu về dịch tễ học Lào và trong khu vực, giúp các nhà khoa học phân tử của HIV đã xác định đƣợc phân týp và cơ quan chuyên ngành của hai nƣớc có 39
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 chính lƣu hành tại Việt Nam. Nghiên cứu của Hoa Kỳ, kiểu gen CRF_25cpx thƣờng chỉ Viện Công Nghệ Sinh học mới phát hiện xuất hiện ở châu Phi [7]. Nhƣ vậy, rất có thể đƣợc 2 phân týp đó là phân týp CRF01_AE BN bị nhiễm từ một ngƣời châu Phi. Tuy (96,7%) và phân týp B (3,3%) (Bạch Thị nhiên, chúng tôi vẫn chƣa xác định đƣợc Nhƣ Quỳnh, 2012) [1]. subtýp của 5,69% số mẫu, do hạn chế của Theo thống kê của Cục Phòng, chống các cặp mồi dùng trong nghiên cứu. So với HIV/AIDS, tỷ lệ nhiễm HIV do lây nhiễm qua các nghiên cứu trƣớc đây, sự phân bố các đƣờng máu và đƣờng tình dục vẫn cao, lây subtýp tại Việt Nam vẫn chƣa có sự thay nhiễm qua đƣờng máu chiếm tỷ lệ cao đổi rõ rệt, tuy nhiên, một số subtýp mới đã nhất, tiếp đến là lây nhiễm qua đƣờng tình xuất hiện. dục và thấp nhất là lây nhiễm qua con KẾT LUẬN đƣờng từ mẹ sang con. Tỷ lệ lây nhiễm qua đƣờng tình dục đƣợc phát hiện riêng trong Đã xác định subtýp HIV-1 bằng mPCR quý I năm 2011 là 43%. Dƣờng nhƣ đang và giải trình tự của 720 mẫu trên các khu có sự chuyển đổi tỷ trọng con đƣờng lây vực nghiên cứu, xác định đƣợc subtýp của nhiễm HIV. Toàn quốc đã phát hiện ngƣời 679 mẫu, trong đó, chủ yếu là subtýp nhiễm HIV tại hơn 75,2% xã/phƣờng, gần CRF01-AE (98,53%), subtýp B (1,33%), 97,9% quận/huyện và 63/63 tỉnh/thành phố. subtýp CRF25_CPX (0,15%). Không xác Trong tổng số ngƣời nhiễm HIV, nam chiếm định đƣợc subtýp của 41 mẫu (5,69%). Sự 69%, nữ: 31%. Tỷ lệ nam giới gấp 2,3 - 2,5 khác biệt về tỷ lệ giữa các phân nhóm theo lần so với nữ. Hình thái lây nhiễm HIV có khu vực nghiên cứu không có ý nghĩa thống sự khác biệt lớn giữa các khu vực trong cả kê với p > 0,05. Phƣơng pháp mPCR đã tối nƣớc. Khu vực miền Nam, tỷ lệ lây nhiễm ƣu sử dụng trong nghiên cứu này nhằm xác HIV qua đƣờng tình dục cao: Thành phố Hồ định các subtýp HIV-1 tại Việt Nam có giá trị Chí Minh, Kiên Giang, Đồng Tháp. Ngƣợc tƣơng đƣơng với phƣơng pháp giải trình lại, các tỉnh miền Bắc, tỷ lệ ngƣời nhiễm HIV tự. qua đƣờng máu lại cao: Hà Nội, Điện Biên, Nghệ An, Thái Nguyên [4]. TÀI LIỆU THAM KHẢO Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp PCR 1. Bạch Thị Như Quỳnh. Nghiên cứu tạo đa mồi đã đƣợc so sánh với giải trình tự để protein tái tổ hợp của HIV-1 và ứng dụng để xác định subtýp HIV trên 288 mẫu HIV-1 (+) phát triển kit chẩn đoán HIV/AIDS. Luận án Tiến cho kết quả tƣơng đƣơng nhau. Trong 720 sỹ Sinh học. Viện Khoa học và Công nghệ Việt mẫu HIV-1 (+), xác định đƣợc subtýp của Nam. 2012. 679 mẫu, trong đó, subtýp AE và B lần lƣợt 2. Đặng Thị Hồng Thắng, Vũ Thị Kim Liên, là 98,53% và 1,33%. Đặc biệt, trong số mẫu Nguyễn Thái Sơn. Nghiên cứu ứng dụng multiplex dƣơng tính đƣợc giải trình tự, xuất hiện PCR xác định phân týp HIV-1 trên đối tƣợng subtýp của mẫu là CRF_25cpx. Đây là mẫu nghiện chất ma túy và gái mại dâm khu vực virut mang đặc điểm của 3 subtýp A, U, G. Hà Nội. Tạp chí Y học Dự phòng. 2009, tập XIX, Theo ghi nhận của Ngân hàng Gen HIV số 4 (112), tr.112-117. 40
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 3. Cục Phòng chống HIV/AIDS. Báo cáo tiến 6. Shalom Spira, Mark A. Wainberg, Hugues độ phòng, chống AIDS Việt Nam năm 2012. Bộ Loemba et al. Impact of clade diversity on HIV-1 Y tế, 2012. virulence, antiretroviral drug sensitivity and drug 4. Sa Ngouane TaVanh và CS. Xác định phân resistance. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. týp HIV-1 trên đối tƣợng nghiện chích ma túy và 2003, 51, pp.229-240. mại dâm khu vực Hà Nội (Việt Nam) và Viêng Chăn (Lào). Tạp chí Y - Dƣợc học quân sự. 2012, 7.. số 01, tr.132-138. HIV/CRFs/CRFs.html. 5. Fumihiro Yagyu A, Shoko Okitsu et al. Determination of HIV-1 subtype by PCR in the transmembrane region with novel primers. Journal of Medical Virology. 2005, 76, pp.16-23. Ngày nhận bài: 16/3/2013 Ngày phản biện đánh giá bài báo: 8/5/2013 Ngày bài báo được đăng: 23/5/2013 41
9. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 42