Chế tạo ghép mạch máu bằng cách kết hợp quá trình khử tế bào Động mạch cartoide lợn và tế bào có nguồn gốc từ mỡ người

Nội dung text: Chế tạo ghép mạch máu bằng cách kết hợp quá trình khử tế bào Động mạch cartoide lợn và tế bào có nguồn gốc từ mỡ người

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Phan Thị Nhàn*; Bùi Quốc Thắng**; Phạm Thọ Tuấn Anh** Trần Lê Bảo Hà*; Trần Công Toại***; Lê Quang Trí**** TÓM TẮT Đặt vấn đề: khử tế bào mạch máu là phương pháp loại bỏ hoàn toàn thành phần tế bào trong mạch máu để tạo ống ghép mạch máu có bản chất là protein tự nhiên của mạch máu. Sau khi khử tế bào, ống ghép mạch máu có cấu trúc, thành phần tương tự như mô tự nhiên, số lượng mẫu lớn, ít gây đáp ứng miễn dịch. Hướng nghiên cứu này rất phát triển trên thế giới và chưa phát triển tại Việt Nam. Phương pháp: sử dụng động mạch cảnh lợn để khử tế bào. Động mạch cảnh sau khi thu nhận được xử lý SDS 0,5%, triton X100 0,1%, nước cất và đánh giá bằng phương pháp nhuộm HE và Trichrome. Đánh giá độc tính mạch máu vô bào in vitro theo tiêu chuẩn ISO 10993-5. Đánh giá tăng sinh tế bào gốc từ mô mỡ trên lòng mạch máu vô bào bằng phương pháp MTT. Kết quả: phương pháp kết hợp SDS 0,5% trong 24 giờ và nước cất 24 giờ đ khử hoàn toàn tế bào và bảo tồn tốt khung nền ngoại bào. Đồng thời, mạch máu vô bào không gây độc tế bào nguyên bào sợi in vitro và giúp cho tế bào gốc từ mô mỡ người phát triển từ ngày 1 tới ngày 7. Kết luận: tạo thành công ống ghép mạch máu từ động mạch cảnh lợn. * Từ khóa: Khử tế bào mạch máu; Ống ghép động mạch cảnh. Fabricating Vascular Grafts by Combination of Decellularization Porcine Cartoid Arteries and Human Adipose Derived Cells Summary Introduction: Decellularization of blood vessels is a method removing all cells in blood vessels to obtain vascular grafts containing native proteins of vessels. After decellularizing, acellular vascular grafts have structure, components similar to native vessels, could be produced largely and evoke less immune response. Methods: Porcine carotid arteries were treated with SDS 0.5% in 24 hours or Triton X100 0.1% in 24 hours or distilled water in 24 hours. Decellularization efficiency was tested by HE and Trichrome staining. Cytotoxicity test was conducted according to ISO 10993-5. Proliferation of hADSC was measured by MTT assay. Results: Combination of SDS 0.5% for 24 hours and distilled water for 24 hours is the best effective decellularization removing total cells and reserving a large amount of extracellular matrix. Moreover, acellular carotid grafts aren’t poisonous for fibroblast in vitro and could support cell growth. Conclusion: Acellular carotid arterial grafts were generated successfully. * Keywords: Decellularization of blood vessel; Acellular carotid arterial graft. * Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. HCM ** Bệnh viện Chợ Rẫy *** Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch **** Bệnh viện Quân y 7A Người phản hồi (Corresponding): Tô Minh Quân (tomquan@hcmus.edu.vn) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017 ĐẶT VẤN ĐỀ với can thiệp mạch máu [1, 3]. Hiện nay, mạch máu tự thân là tiêu chuẩn vàng Mỗi năm có > 600.000 ca bắc cầu động trong bắc cầu động mạch. Tuy nhiên, 1/3 mạch thực hiện ở Mỹ, gần tương đương số bệnh nhân (BN) không có mạch máu 196
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 với chất lượng phù hợp. Các loại vật liệu của nghiên cứu: Thử nghiệm phương pháp ghép trên thị trường như Dacron, PTFE khử tế bào hiệu quả đối với động mạch không phù hợp đối với mạch máu đường cảnh lợn và thử nghiệm đánh giá tăng kính nhỏ (đường kính < 5 mm) như động sinh tế bào hADSC trên ống ghép mạch mạch vành [6]. máu vô bào. Khử tế bào là một phương pháp mới hiện nay. Mô, cơ quan được cấu tạo bởi ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 2 thành phần: tế bào và khung nền ngoại NGHIÊN CỨU bào (extracellular matrix - ECM). Tế bào 1. Đối tượng nghiên cứu. là đơn vị cấu trúc và chức năng của mô. Động mạch cảnh lợn và tế bào gốc từ mô Trong quá trình sống, tế bào tiết ra bên mỡ người (hADSC) (Trường Đại học Y Khoa ngoài tế bào những phân tử ngoại bào Phạm Ngọc Thạch cung cấp). như protein, polysaccharide, proteoglycan Những phân tử này tạo thành khung nền 2. Phương pháp nghiên cứu. ngoại bào (ECM) [4]. Phương pháp khử Theo phương pháp thực nghiệm miêu tả. tế bào nhằm loại đi thành phần tế bào * Phương pháp khử tế bào: bên trong mô, cơ quan và giữ lại ECM. ECM của mỗi mô, cơ quan là mảnh ghép Vận chuyển mạch máu về phòng thí tốt đối với mô, cơ quan đó [11]. Ống ghép nghiệm trong dung dịch PBS ở 40C, sau đó mạch máu được tạo ra bằng phương pháp tách bỏ các lớp cơ, mỡ xung quanh trong điều khử tế bào có cấu trúc, hình dạng tương kiện vô trùng. Xử lý mạch máu với từng hóa tự như mạch máu tự thân, số lượng lớn chất để khử tế bào: nước cất trong 24 giờ nhưng có khả năng gây ra đáp ứng miễn hoặc SDS 0,5% trong 24 giờ hoặc triton X100 dịch [7]. 0,1% trong 24 giờ. Đánh giá hiệu quả khử tế bào Tế bào gốc từ mô mỡ (hADSC) là nguồn bằng phương pháp nhuộm tế bào tự thân được quan tâm nhiều hiện heamatoxylin/eosin (HE) và Trichrome. nay. Một số nghiên cứu cho rằng hADSC * Phương pháp đánh giá độc của mạch có khả năng biệt hóa thành 2 dòng tế bào máu vô bào: quan trọng trong mạch máu là tế bào nội mô và tế bào cơ trơn [5]. Đặc biệt, thiếu Đánh giá độc tính tế bào theo tiêu tế bào nội mô sẽ làm cho ống ghép mạch chuẩn ISO 10993-5. Ống ghép mạch máu cắt 2 máu bị đông máu trong lòng mạch, điều này thành những mảnh 0,3 x 0,3 cm . Cấy ảnh hưởng tới tính mạng của BN. Tế bào nguyên bào sợi lên đĩa 4 giếng với nồng độ 3 x 4 hADSC khắc phục được nhược điểm lớn 10 tế bào/giếng. Sau 1 ngày, đặt mảnh ống nhất của 2 dòng tế bào trên, hADSC có ghép lên lớp tế bào trong đĩa (1 mảnh/giếng khả năng thu nhận tự thân dễ dàng với số tế bào). Sau 1 ngày, loại bỏ mảnh ống ghép, lượng lớn. tiến hành quan sát hình dạng tế bào trên đĩa Hiện nay, ở Việt Nam, nghiên cứu khử và thực hiện phương pháp MTT đối với đĩa thí tế bào mạch máu để thu nhận ống ghép nghiệm và đĩa đối chứng (đĩa tế bào không mạch máu vẫn chưa phát triển. Mục tiêu đặt mảnh ống ghép). 198
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Phương pháp đánh giá tăng trưởng tế cấy tế bào) và 3 mảnh ống ghép đối chứng bào hADSC trên lòng mạch máu vô bào: (mảnh không được cấy tế bào). Cắt mạch máu khử tế bào thành các đoạn Quy trình MTT: thay môi trường trong 0,4 x 0,4 cm2. Thu nhận tế bào hADSC thế hệ giếng, bổ sung MTT 5 mg/ml vào môi trường P4, chỉnh về mật độ 2 x 105 tế bào/ml và cấy nuôi, ủ 37oC trong 4 giờ, sau đó hút bỏ môi lên bề mặt lòng trong mảnh ghép với thể tích trường cũ, thêm vào DMSO (thể thích tương 10 µl/mảnh. đương với môi trường nuôi) để hòa tan tinh Đánh giá tăng sinh tế bào bằng phương thể và tiến hành đo OD ở bước sóng 595 nm. pháp MTT qua các mốc thời gian 1, 3, 5, 7, 9, Đánh giá bám dính tế bào bằng kính hiển vi 11 ngày. Mỗi ngày tiến hành đánh giá MTT điện tử quét (SEM). với 3 mảnh ống ghép thí nghiệm (mảnh được KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả khử tế bào động mạch. Hình 1: Động mạch lợn sau xử lý. A B Hình 2: Kết quả nhuộm mô học mạch máu tự nhiên (x100). (A: Nhuộm HE; B: Nhuộm trichrome) 199
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 A B C D Hình 3: Kết quả nhuộm mô học HE mạch máu xử lý với các chất tẩy tế bào (x100). (A: Nước cất 24 giờ; B: Tritonx100 0,1% 24 giờ; C: SDS 0,5% 24 giờ; D: SDS 0,5% 24 giờ và nước cất 24 giờ) A B Ph ân lập và nu ôi cấ y C tăD ng a sin h Hình 4: Kết quả nhuộm mô học Trichrome mạch máu xử lý với các chất tẩy tế bào (x100). (A: Nước cất 24 giờ; B: Tritonx100 0,1% 24 giờ; C: SDS 0,5% 24 giờ; D: SDS 0,5% 24 giờ và nước cất 24 giờ) 199
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Bảng 1: Tóm tắt hiệu quả khử tế bào và bảo tồn collagen của các phương pháp khác nhau. Tác nhân khử tế bào Hiệu quả khử tế bào Hiệu quả bảo tồn collagen Nước cất 2 lần + ++++ Triton x100 + ++++ SDS ++++ +++ SDS kết hợp với nước cất 2 lần +++++ +++ (+: 0 - 20%; ++: 20 - 40%; +++: 40 - 60%; ++++: 60 - 80%; +++++: 80 - 100%) Động mạch thu được có kích thước khác nhau không giống nhau (bảng 1). trung bình 9 cm. Sau khi khử tế bào, động SDS 0,5% trong 24 giờ là phương pháp mạch có màu trắng, vẫn duy trì hình dạng khử tế bào hiệu quả nhưng cũng là phương và kích thước như ban đầu (hình 1). Kết quả pháp biến tính collagen mạnh nhất. Nước nhuộm HE cho thấy mạch máu sau xử lý cất trong 24 giờ là phương pháp giữ vẫn duy trì được cấu trúc ba lớp như mạch collagen tốt nhất nhưng cũng là phương đối chứng (hình 2, 3). Kết quả nhuộm pháp khử tế bào kém nhất. Khi kết hợp Trichrome cho thấy mạch máu sau xử lý 2 phương pháp lại với nhau (SDS 24 giờ vẫn duy trì protein collagen trong 3 lớp tế và nước cất 24 giờ) sẽ có phương pháp bào (hình 2, 4). Tuy nhiên, kết quả nhuộm khử tế bào hiệu quả nhất: tế bào được HE và Tricrhome cho thấy hiệu quả khử loại bỏ hoàn toàn và collagen được bảo tế bào và duy trì collagen của các tác nhân tồn tốt. 2. Kết quả đánh giá độc tính tế bào. Hình 5: Kết quả thử nghiệm độc tính tế bào của mạch máu vô bào (x40). 200
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Độc tính tế bào được đánh giá bằng phương pháp ISO 10993-5 theo cách trực tiếp. Mảnh mạch máu vô bào đặt trực tiếp lên tế bào nguyên bào sợi. Sau 1 ngày, kết quả quan sát bằng mắt thường cho thấy rất ít tế bào bên dưới giá thể co tròn hoặc bong ra, chứng tỏ giá thể không độc với nguyên bào sợi. Kết quả MTT cho thấy hiệu quả gây độc tế bào của mạch máu vô bào rất thấp. Giá trị OD nhóm thí nghiệm (TN) là 0,23 ± 0,015, nhóm đối chứng 0,26 ± 0,002. Tỷ lệ TNĐC khoảng 88%, cấp độ độc tính: không độc. 3. Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc từ mô mỡ ngƣời trên mạch máu vô bào. Hình 6: Kết quả chụp SEM mạch máu vô bào được cấy với tế bào từ mô mỡ người. Tế bào gốc từ mô mỡ người được cấy vào lòng mạch máu vô bào với mật độ 2 x 103 tế bào/mảnh ống ghép. Kết quả đánh giá tăng sinh tế bào bằng MTT cho thấy giá trị OD của dung dịch tăng sinh từ ngày 1 tới ngày 7, sau đó duy trì cân bằng. Kết quả này cho thấy tế bào tăng sinh được từ ngày 1 tới ngày 7, sau đó duy trì ổn định. Kết quả chụp SEM cho thấy tế bào bám dính vào bề mặt lòng trong mảnh ống ghép. Biểu đồ 1: Đồ thị biểu diễn tăng sinh tế bào từ mô mỡ người trên mạch máu vô bào được đánh giá bằng phương pháp MTT. 201
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 BÀN LUẬN nền. Đồng thời, hiệu quả của từng phương pháp phụ thuộc vào bản chất của mô, cơ Theo thống kê của Hiệp hội Tim mạch quan [7]. Phương pháp khử tế bào hiệu Hoa Kỳ (2017), bệnh tim mạch dẫn tới quả là khử hoàn toàn tế bào bên trong 1/3 số ca tử vong ở người Mỹ. Bệnh động mô nhưng vẫn duy trì lớp protein. Nước mạch vành chiếm khoảng 45% số ca tử cất là dung dịch nhược trương thường vong nói trên. Nguyên nhân chính của bệnh được sử dụng khử tế bào. Phân tử nước tim mạch là do hiện tượng xơ vữa mạch di chuyển vào bên trong tế bào và làm tế máu. Hai phương pháp thường được sử dụng là can thiệp mạch máu và bắc cầu bào vỡ ra. Hiệu quả khử tế bào của nước động mạch. Trong đó, bắc cầu hay được cất không cao. Tuy nhiên, hay sử dụng để sử dụng trong trường hợp bệnh nặng, làm chất hỗ trợ quá trình khử tế bào. trên nhiều nhánh hoặc thất bại trong bắc Triton X100 là chất tẩy không ion hóa. cầu mạch máu [1, 3]. Hiệu quả khử tế bào của triton x100 tốt hơn so với nước, tuy nhiên, triton x100 Mạch máu tự thân luôn là tiêu chuẩn cũng gây ảnh hưởng tới ECM bên ngoài. vàng trong ghép mạch máu. Tuy nhiên, rất nhiều BN không có mạch máu tự thân SDS là chất tẩy có tính ion. Hiệu quả khử có chất lượng phù hợp và BN phải trải tế bào của SDS khá cao, có khả năng gây qua thêm một cuộc phẫu thuật nữa. Mạch biến tính ECM cao hơn [10]. Kết quả thực đồng loại, đặc biệt là mạch máu dị loại có nghiệm cho thấy SDS 0,5% trong 24 giờ số lượng lớn, cấu trúc phù hợp với mạch là phương pháp tốt nhất để khử tế bào. máu cần thay thế. Nhược điểm lớn nhất Tuy nhiên, phương pháp này vẫn chưa của 2 loại mạch máu này là phản ứng thải loại bỏ hoàn toàn tế bào bên trong mạch loại miễn dịch. Phương pháp khử tế bào máu. Để gia tăng hiệu quả khử tế bào, xuất hiện để giải quyết nhược điểm này. SDS 0,5% trong 24 giờ được sử dụng kết Mô cấu tạo bởi tế bào và ECM. Trong 2 hợp với nước cất 2 lần trong 24 giờ. thành phần trên, tế bào là thành phần Kết quả cho thấy hiệu quả khử tế bào gia miễn dịch chính của mô và quá trình loại tăng, khử hoàn toàn tế bào trong mạch bỏ tế bào sẽ dẫn tới suy giảm tính kích máu và bảo toàn tốt ECM. thích miễn dịch và hiệu quả ghép tăng Để có thể ứng dụng rộng rãi, mạch cao [8]. máu vô bào cần được kiểm tra khả năng Hiện nay, nhiều phương pháp khử gây độc tế bào và hỗ trợ tế bào tăng sinh. tế bào được sử dụng trên khắp thế giới. Hai tiêu chuẩn này là yêu cầu bắt buộc Phương pháp khử tế bào được chia thành đối với ống ghép mạch máu nhằm tạo ra các nhóm sau: phương pháp vật lý, phương mạch máu có chức năng và có thể tái cấu pháp hóa học, phương pháp protein. Mỗi trúc trong cơ thể. Dựa vào kết quả thử phương pháp đều có hiệu quả nhất định nghiệm theo tiêu chuẩn ISO 10993-5, kết trong khử tế bào và bảo tồn protein khung quả định tính (quan sát hình dạng tế bào) 202
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 và định lượng (đánh giá bằng phương pháp Việc nghiên cứu để tạo thành mạch MTT) cho thấy mạch máu vô bào không máu kỹ nghệ hóa vẫn đang là một thách gây độc tới tế bào (tất cả đều ở cấp không thức trên toàn thế giới. Quá trình này cần gây độc). nhiều yếu tố: khung mạch máu, tế bào, Đồng thời, tế bào hADSC cấy lên lòng nhân tố trăng trưởng, nuôi cấy động [6]. trong của ống ghép mạch máu vô bào. Để hướng tới những ứng dụng xa hơn, Hai thành phần tế bào quan trọng trong cần đánh giá độc tính và tương hợp in mạch máu là tế bào cơ trơn và tế bào nội mô [5]. Tế bào cơ trơn là thành phần vivo trên cơ thể động vật, người về biệt tế bào chủ yếu của lớp giữa mạch máu. hóa tế bào hADSC thành tế bào cơ trơn Tế bào cơ trơn xếp thành những vòng và nội mô , cấy và nuôi các tế bào trên tròn đồng tâm và chịu trách nhiệm co bóp lòng mạch với thời gian dài hơn để tái tạo nhằm dẫn truyền dòng máu. Tế bào nội cấu trúc tương tự như mô tự nhiên mô tạo thành lớp chống đông máu trong Nghiên cứu này là bước đầu trong quá lòng mạch. Do đó, tế bào nội mô và tế bào cơ trơn đóng vai trò quyết định hình trình tạo ra ống ghép mạch máu phù hợp thành ống ghép mạch máu chức năng. cho BN. Kết quả ban đầu cho thấy ống Đặc biệt, thiếu tế bào nội mô sẽ làm cho ghép mạch máu vô bào có khả năng ứng ống ghép mạch máu bị đông máu trong dụng trong lĩnh vực kỹ nghệ mạch máu: lòng mạch, ảnh hưởng tới tính mạng của cấu trúc, hình dạng, thành phần tương tự BN [9]. Tuy nhiên, nguồn tế bào cơ trơn và tế bào nội mô tự thân rất hiếm. Do đó, như mạch máu tự nhiên, hỗ trợ tốt cho tế hướng nghiên cứu mới đó là biệt hóa bào tăng sinh, quy trình xử lý đơn giản, dòng tế bào tự thân thành tế bào cơ trơn rẻ tiền, số lượng mẫu nhiều. và tế bào tiền thân nội mô. Một trong những dòng tế bào được quan tâm nhiều KẾT LUẬN hiện nay là tế bào gốc từ mô mỡ người (hADSC). Các tế bào này thu nhận từ mỡ Tạo thành công ống ghép mạch máu tự thân và được chứng minh có khả năng bằng phương pháp khử tế bào động mạch biệt hóa thành tế bào nội mô và tế bào cơ cảnh lợn. trơn [12]. Ngoài ra, một nghiên cứu cho thấy tế bào hADSC có khả năng kêu gọi LỜI CẢM ƠN tế bào nội mô từ những mô xung quanh khi ghép vào trong cơ thể [2]. Kết quả Đề tài được thực hiện từ Chương trình đánh giá bằng phương pháp MTT và SEM Vườn ươm Sáng tạo Khoa học Công nghệ cho thấy khi cấy hADSC lên ống ghép Trẻ được quản lý bởi Trung tâm Phát mạch máu vô bào, tế bào hADSC tăng triển Khoa học Công nghệ Trẻ, Thành trưởng gấp 4 lần sau 7 ngày nuôi cấy. đoàn Thành phố Hồ Chí Minh, theo hợp Như vậy, ống ghép mạch máu vô bào hoàn toàn phù hợp cho tế bào tăng sinh đồng số “09/2017/HĐ-KHCN-VƯ” do Thạc sỹ và phát triển. Tô Minh Quân làm chủ nhiệm đề tài. 203
9. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO 7. Crapo P.M et al. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. 1. Alexander J.H et al. Coronary-Artery 2011, 32, pp.3233-3243. Bypass Grafting. 2016, 374, pp.1954-1964. 8. Dahl Shannon L.M et al. Decellularized 2. Bajpai V.K et al. Stem cell sources for Native and Engineered Arterial Scaffold for vascular tissue engineering and regeneration. Transplantation. 2003, 12, pp.659-666. 2012, 18, pp. 405-425. 9. Geenen I.L et al. Endothelial cells (ECs) 3. Benjamin E.J et al. Heart disease and for vascular tissue engineering: venous ECs stroke statistics-2017 Update: A report from are less thrombogenic than arterial ECs. the American Heart Association. 2017, 135, 2015, 9, pp.564-576. e146-e603. 10. Gilpin A et al. Decellularization Strategies 4. Bonnans Caroline et al. Remodelling the for Regenerative Medicine: From Processing extracellular matrix in development and disease. Techniques to Applications. 2017, 9831534. 2014, 15, pp.786-801. 11. Hoshiba T. Cultured cell-derived decellularized 5. Catto Valentina et al. Vascular tissue matrices: a review towards the next decade. engineering: Recent Advances in Small Diameter 2017, 5, pp.4322-4331. Blood Vessel Regeneration. 2014, pp.1-27. 12. Huang N.F et al. Mesenchymal stem 6. Chang William G et al. A short discourse cells for vascular regeneration. 2008, 3, on vascular tissue engineering. 2017, 2. pp.877-892 204