Cấu trúc van tim của lợn đông lạnh trong môi trường không có FBS

Nội dung text: Cấu trúc van tim của lợn đông lạnh trong môi trường không có FBS

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Dương Công Nguyên*; Mầu Văn Cảnh*; Cấn Thị Thu Hằng* Lê Thị Hồng Nhung*; Ngô Duy Thìn* TÓM TẮT 30 mẫu mô van tim lợn chia làm 3 nhóm: 10 mẫu không bảo quản, 10 mẫu được bảo quản lạnh sâu ở môi trường có huyết thanh (FBS) và 10 mẫu bảo quản trong môi trường không có FBS. Thời gian bảo quản 10 tuần theo quy trình của Labo Công nghệ Mô ghép, Bộ môn Mô - Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội. Đánh giá cấu trúc đại thể, vi thể sau bảo quản. So sánh giữa các lô và lô chứng. Kết quả: không có sự khác biệt về cấu trúc đại thể, vi thể giữa lô chứng (không bảo quản) và các lô bảo quản. Không có sự khác biệt về cấu trúc giữa lô bảo quản trong môi trường có huyết thanh (FBS) và không có huyết thanh. * Từ khóa: Mô van tim; Bảo quản lạnh sâu; Huyết thanh bào thai bò. Structure of the Heart Valve of Pig Cryopreserved in Medium without FBS Summary 30 tissue heart valve samples of pig were cryopreserved in the medium within fetal bovine serum (FBS) and without FBS for 10 weeks at the Department of Histology and Embryology, Hanoi Medical University. Results: There was no significant difference in macro and microstructural changes among storage groups in FBS, not FBS and control. * Keywords: Tissue heart valve; Cryopreservation; Fetal bovine serum. ĐẶT VẤN ĐỀ sinh học được ưu tiên sử dụng nhiều trên thế giới. Tại Đức, năm 2008 trong tổng số Nhu cầu thay van tim hiện nay rất lớn, 12.000 BN có tới 78% BN ghép van sinh mỗi năm có trên 290.000 bệnh nhân (BN) học, 21% ghép van cơ học và chỉ 1% van cần thay van và dự báo lên tới 850.000 BN được sửa [1]. trước năm 2050. Có 2 loại van tim được Van nhân tạo sinh học có nguồn gốc từ sử dụng thay thế van bệnh lý là van cơ động vật như lợn, bò... đ qua các khâu học và van sinh học. Van sinh học bao xử lý, có ưu điểm ít phải sử dụng thuốc gồm van nhân tạo sinh học từ động vật và chống đông, nhưng lại có thời gian sử van đồng loại (homograft). Thực tế, van dụng rất ngắn (6 - 8 năm ở người trẻ tuổi). * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Ngô Duy Thìn (ngoduythin@gmail.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017 Để giải quyết tình trạng này, nhiều nhà cho chết não, còn tế bào sống để ghép khoa học đ sử dụng van tim từ người đồng loài. Van tim lấy từ đồng loài không 166
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 cần dùng thuốc chống đông, có thể sử ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP dụng trên 20 năm mới thoái hóa, ưu thế NGHIÊN CỨU vượt trội so với các chất liệu nhân tạo 1. Đối tƣợng nghiên cứu. trong bệnh lý van tim do viêm nội tâm 30 mẫu van động mạch chủ lợn khỏe mạc nhiễm khuẩn, thay van trong bệnh mạnh, có độ tuổi và cân nặng giống nhau, tim bẩm sinh và trẻ em [2]. không phân biệt giới, kích thước mảnh mô Để chủ động được nguồn cho và nhận 3 x 4 cm bao gồm lá van. khi ghép, việc bảo quản mô van tim phục 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. vụ cấy ghép đồng loài đ được thực hiện * Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tại nhiều ngân hàng mô trên thế giới. tả phân tích. Quy trình bảo quản mô van tim tương đối * Phân nhóm nghiên cứu: thống nhất, bao gồm: sử dụng kháng sinh Trên cùng một van tim lấy 3 lá van: khử khuẩn, DMSO làm chất bảo vệ lạnh, 1 lá van không bảo quản là lá van chứng, hạ nhiệt độ theo chương trình [3]. Tuy nhiên, 1 lá van bảo quản lạnh trong môi trường việc bổ sung FBS trong môi trường bảo có FBS, 1 lá van bảo quản lạnh trong môi quản mô van tim còn nhiều tranh cãi. trường không có FBS. Theo các tác giả, môi trường bảo quản - Nhóm chứng: 10 mẫu, không bảo quản. cần bổ sung ít nhất 10% huyết thanh có - Nhóm thực nghiệm: tác dụng dinh dưỡng cho tế bào giai đoạn sau rã đông, góp phần tăng tỷ lệ sống + 10 mẫu van tim lợn bảo quản lạnh trong môi trường có FBS. của tế bào, tuy nhiên việc sử dụng FBS (huyết thanh bào thai bò) còn tồn tại + 10 mẫu van tim lợn bảo quản lạnh trong nhiều nguy cơ nhiễm khuẩn, biến đổi di môi trường không có FBS. truyền cũng như tăng chi phí bảo quản * Quy trình nghiên cứu: [4]. Điều này đặt ra vấn đề có thể giảm - Thu nhận và vận chuyển van tim: tim hoặc bỏ hẳn FBS trong bảo quản lạnh lợn lấy tại lò mổ ngay sau khi giết, cùng hay không, đặc biệt là bảo quản trong một thời điểm. Bảo quản tim trong thùng thời gian ngắn. Do vậy, chúng tôi thực chuyên dụng chứa huyết thanh mặn đẳng hiện đề tài với mục tiêu: So sánh cấu trúc trương lạnh vô khuẩn, nhanh chóng vận mô van tim lợn bảo quản trong môi trường chuyển về labo. có huyết thanh và không có huyết thanh. - Phẫu tích lấy mô van tim trong Hood vô trùng tại labo. - Bảo quản van tim gồm 4 bước chính: khử khuẩn, hạ nhiệt độ, bảo quản lâu dài và r đông. 168
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 + Khử khuẩn: sử dụng hỗn hợp kháng parafin nóng chảy, cắt mẫu thành những sinh cefoxitin 240 µg/ml, lincomycin lát mỏng 3 - 5 µm. 120 µg/ml, vancomycin 50 µg/ml, + Nhuộm theo phương pháp Masson amphotericin B 25 µg/ml ở 40C trong với 3 dung dịch: hematoxylin, axít Fuchsin - 24 giờ. Bảo quản trong môi trường A gồm Ponceau S, blue aniline (xanh methyl). RPMI 1640, 10% DMSO, môi trường B: môi + Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi 0 trường A bổ sung 10% FBS để lạnh 4 C. quang học ở độ phóng đại 250x và 1000x. Đóng gói 2 lớp vô trùng. * Chỉ tiêu nghiên cứu: + Hạ nhiệt độ: theo chương trình, tốc độ - Các chỉ tiêu đánh giá hình thái đại thể trung bình 10C/phút đến -800C. mô van tim lợn: + Bảo quản lâu dài trong tủ lạnh sâu bảo + Tình trạng toàn vẹn mẫu mô: nguyên quản ở - 800C. vẹn, rách, nứt, vỡ. + R đông: r đông nhanh, loại bỏ dung + Màu sắc mẫu mô van tim: trắng trong dịch bảo quản lạnh chứa chất bảo vệ lạnh giống van tim tươi. bằng nước muối sinh lý ở nhiệt độ thường. - Chỉ tiêu đánh giá hình thái vi thể mô van tim lợn: * Đánh giá cấu trúc sau bảo quản: + Lớp tế bào nội mô: liên tục (+), không - Đánh cấu trúc đại thể: chụp ảnh trước liên tục (-). và sau bảo quản ở các lô. + Nguyên bào sợi: đánh giá mật độ phân - Đánh giá cấu trúc vi thể: lớp tế bào bố so với mẫu van tim chứng tươi: ít (+), nội mô, nguyên bào sợi, mô kẽ của lá van trung bình (++), nhiều (+++). bằng tiêu bản nhuộm hematoxylin-eosin + Phù nề mô kẽ: có (+) hoặc không (-). (H.E). + Sắp xếp sợi collagen: liên tục song + Cố định trong dung dịch formol 10%. song (+), không liên tục, đứt gãy (-) Đúc đứng miếng mô trong parafin nóng chảy, * Thời gian, địa điểm nghiên cứu: cắt mẫu thành những lát mỏng 3 - 5 µm. - Địa điểm: Bộ môn Mô Phôi, Trường + Nhuộm tiêu bản bằng H.E. Đại học Y Hà Nội. + Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi - Thời gian: nghiên cứu tiến hành từ quang học ở độ phóng đại 250x và 1000x. tháng 1 - 2017 đến 5 - 2017. - Quan sát cấu trúc sợi liên kết: sợi * Đạo đức trong nghiên cứu: collagen, sợi elastin bằng kỹ thuật nhuộm Đề tài hoàn toàn làm thực nghiệm Masson. trên động vật. Hạn chế tối đa số động vật + Cố định bệnh phẩm trong dung dịch giết mổ nhưng vẫn đảm bảo đủ số mẫu formol 10%, đúc đứng miếng mô trong nghiên cứu. 169
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Cấu trúc đại thể A B C Hình 1: Hình ảnh đại thể mô van tim trước bảo quản và sau bảo quản lạnh. (A: van tim chứng (không bảo quản); B: van bảo quản với FBS; C: van bảo quản không có FBS) Sau bảo quản, van tim vẫn giữ được sự nguyên vẹn, màu sắc trắng trong so với van chứng. Không có sự khác biệt về hình thái đại thể giữa nhóm trước bảo quản và sau bảo quản, nhóm bảo quản lạnh có FBS và nhóm không có FBS. 2. Hình ảnh vi thể nhuộm H.E. Tế bào nội mô Tế bào nội mô Tế bào nội mô A Nguyên bào sợi B Nguyên bào sợi C Nguyên bào sợi Hình 2: Hình ảnh vi thể nhuộm H.E mô van tim (H.E x1000). (A: mô van tươi; B: mô van tim sau bảo quản lạnh sâu có FBS; C: mô van tim sau bảo quản lạnh sâu không có FBS) Quan sát hình ảnh vi thể nhuộm H.E các mô van tim trước bảo quản, bảo quản trong môi trường có FBS và bảo quản trong môi trường không có FBS, chúng tôi nhận thấy cấu trúc mô nguyên vẹn, hệ thống sợi liên kết liên tục, không đứt, gãy. Lớp tế bào nội mô liên tục, không bong tách; nhìn rõ, phân biệt được các lớp của mô van tim; mật độ phân bố nguyên bào sợi đồng đều; không thấy hình ảnh phù nề mô kẽ. 169
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 3. Hình ảnh vi thể nhuộm Masson. Bó sợi liên kết Bó sợi liên kết Bó sợi liên kết A B C Hình 3: Hình ảnh vi thể nhuộm Masson mô van tim (Masson x1000). (A: mô van tươi; B: mô van tim sau bảo quản lạnh sâu có FBS; C: mô van tim sau bảo quản lạnh sâu không có FBS) Quan sát trên tiêu bản nhuộm Masson các mô van tim trước bảo quản, bảo quản trong môi trường có FBS và môi trường không có FBS thấy các sợi collagen bắt màu xanh da trời xếp thành từng bó sợi, song song với nhau có hình dạng lượn sóng. Bảng 1: Kết quả quan sát cấu trúc vi thể van tim của nhóm nghiên cứu trên tiêu bản nhuộm H.E và nhuộm Masson (150 tiêu bản/30 mẫu nghiên cứu). Nhóm bảo quản Nhóm bảo quản Chỉ tiêu Nhóm chứng có FBS không có FBS Sự sắp xếp lớp tế bào nội mô liên tục + + + Mật độ phân bố của nguyên bào sợi đồng đều +++ +++ +++ Có phù nề mô kẽ - - - Sợi collagen liên tục, mềm mại + + + BÀN LUẬN từng bó song song theo chiều dọc của lá van tim. Có một vài khoảng trắng trên Kết quả nghiên cứu trên hình ảnh đại một vài tiêu bản vi thể, tuy nhiên cũng thể và vi thể thấy: các mô van tim sau bảo quản tại thời điểm 10 tuần ở cả nhóm bảo quan sát thấy các khoảng trắng tồn tại quản có FBS và không có FBS so với trên cả mẫu van chứng không bảo quản. nhóm chứng không thấy biến đổi về cấu Như vậy, không có sự khác biệt về mặt trúc đại thể và vi thể. Đặc biệt, trên tiêu vi thể giữa nhóm bảo quản có huyết thanh bản nhuộm Masson ở cả ba nhóm, chúng và nhóm không có huyết thanh và so với tôi thấy các sợi liên kết rõ ràng, xếp thành nhóm chứng. 170
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Kết quả này phù hợp với nghiên cứu Không có sự khác biệt đáng kể giữa hai của Kenvin G.M (2011) trên 3 nhóm: van nhóm vào bất kỳ thời điểm nào. Kết quả tim chứng không bảo quản, nhóm bảo này cho thấy nguyên bào sợi được duy trì quản trong môi trường có chứa DMEM, đầy đủ ngay cả sau 3 tháng bảo quản 10% DSMO, 10% FBS và nhóm bảo quản lạnh, việc bổ sung huyết thanh không làm không có huyết thanh. Kết quả cho thấy tăng khả năng sống của chúng. Vì vậy, không có sự thay đổi cấu trúc mô học qua qua đánh giá tỷ lệ sống của nguyên bào kính hiển vi huỳnh quang ở hai nhóm bảo sợi, tác giả cho rằng không cần phải sử quản có huyết thanh và không có huyết dụng huyết thanh để bảo quản lạnh mô thanh so với nhóm chứng. Kenvin G.M cũng van tim [6]. chỉ ra các khoảng trắng có cả trên tiêu bản Nghiên cứu của Feng X.J và CS (1992) vi thể nhóm bảo quản với FBS và nhóm trên van tim lợn, chia 3 nhóm bảo quản van chứng không bảo quản. Ngoài ra, lạnh ở -1960C với các môi trường khác tác giả cũng đánh giá so sánh thêm tiêu nhau, môi trường A gồm RPMI-1640, chí khác: tỷ lệ tế bào sống và độ đàn hồi 10% DMSO và 5% FBS; môi trường B của van tim. Tỷ lệ sống của tế bào mô gồm RPMI-1640, 10% DMSO và 10% FBS; van tim ở nhóm bảo quản đều giảm một môi trường C gồm RPMI-1640, 10% DMSO. nửa so với nhóm chứng (p < 0,05), không Kết quả thu được cho thấy chức năng có sự khác biệt r ràng về tỷ lệ sống của của tế bào nội mô của nhóm B và nhóm tế bào và độ đàn hồi ở hai nhóm bảo quản C tốt hơn có ý nghĩa so với nhóm A, có huyết thanh và không có huyết thanh không có sự khác biệt về chức năng tế (p > 0,05) [5]. bào nội mô giữa nhóm B và nhóm C, theo Nakayama S và CS (1994) nghiên cứu đó tác giả kết luận FBS không cần thiết đánh giá tác dụng bảo vệ của huyết thanh trong bảo quản lạnh sâu, thậm chí không trên bảo quản lạnh mô van động mạch nên dùng [7]. chủ. 10 van động mạch chủ được chia hai Người ta cho rằng bổ sung huyết thanh nhóm bảo quản lạnh trong môi trường vào môi trường bảo quản vì những lợi DMEM có chứa 10% huyết thanh và trong ích: nó có chứa những yếu tố kích thích môi trường DMEM không có huyết thanh. tăng trưởng và hormon; là một hệ đệm, Đánh giá khả năng sống nguyên bào có những protein mang làm nhiệm vụ sợi khi van tươi, sau bảo quản 1 tuần và vận chuyển vật chất qua màng tế bào... 3 tháng. Tỷ lệ các nguyên bào sợi sống Tuy nhiên, huyết thanh có những ảnh giảm xuống mức độ tương tự ở cả hai hưởng và hạn chế: thiếu tính đồng nhất nhóm mô sau 1 tuần bảo quản: 81,1% ± về thành phần, cần phải kiểm tra chất 2,5% ở nhóm A và 80,4% ± 3,3% nhóm B. lượng mỗi lô trước khi đem vào sử dụng, Sau 3 tháng bảo quản, khả năng sống có thể chứa một vài yếu tố ức chế làm của nguyên bào sợi giảm nhẹ xuống hạn chế tế bào phát triển, nguy cơ nhiễm khoảng 73% đối với cả hai nhóm mô. khuẩn. Số liệu dịch tễ học đ chỉ ra bệnh 171
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 bò điên có thể chuyển từ gia súc sang LỜI CẢM ƠN người thông qua các sản phẩm dược phẩm Nghiên cứu thuộc phạm vi đề tài cấp sinh học. FBS cũng là một nguồn ẩn chứa Bộ Y tế: “Nghiên cứu xây dựng quy trình các tác nhân virút, mycoplasma, vi khuẩn và lấy, bảo quản và ghép van tim đồng loại”. có thể đưa chất gây sốt vào môi trường Nhóm nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn tới bảo quản [8]. Những hạn chế của huyết Bộ Y tế đ tài trợ cho nghiên cứu. thanh có yếu tố có thể kiểm soát được như nguy cơ nhiễm khuẩn, nhưng có yếu TÀI LIỆU THAM KHẢO tố không thể kiểm soát được như thành 1. Gummert J.F et al. Cardiac surgery in phần của huyết thanh, các chất được coi Germany during 2007: a report on behalf of the là protein ức chế... Do đó, huyết thanh German Society for Thoracic and Cardiovascular có ảnh hưởng mà con người không thể Surgery. Thorac Cardiovasc Surg. 2008, 56, dự đoán. pp.328-336. Như vậy, nghiên cứu của chúng tôi trên 2. Parker R. Banking of heart valves. mô van tim thấy cấu trúc đại thể, vi thể ở Galea G (ed) Essentials of tissue banking. st nhóm bảo quản có huyết thanh và không 2010, 1 ed, pp.69-80. có huyết thanh không có sự khác biệt 3. Heng W.L et al. International heart valve và không khác biệt so với nhóm chứng. bank survey: a review of processing practices and activity outcomes. Journal of Transplantation. Tuy nhiên, cần đánh giá khả năng sống 2013. của nguyên bào sợi và tế bào nội mô, 4. Armitage J et al. Heart valve cryopreservation: khả năng tổng hợp collagen của nguyên Protocol for addition of dimethyl sulphoxide bào sợi, thời gian bảo quản cần nghiên cứu and amelioration of putative amphotericin B dài hơn. Kết quả nghiên cứu này có thể toxicity. Cryobiology. 2005, 50, pp.139-143. gợi ý cho việc không sử dụng FBS trong 5. Kelvin G.M, Albert E.H et al. Guidance bảo quản mô van tim trong thời gian ngắn. for removal of fetal bovine serum from cryopreserved heart valve processing. Cell KẾT LUẬN Tissues Organs. 2011, 193 (3), pp.264-273. [ 6. Nakayama S, Ban T, Okamoto Y et al. Nghiên cứu so sánh biến đổi về hình Fetal bovine serum is not necessary for the thái cấu trúc của mô van tim lợn sau bảo cryopreservation of aortic valve tissues. J Thorac quản lạnh trong môi trường có huyết thanh Cardiovasc Surg. 1994, 10 (3), pp.583-586. và môi trường không có huyết thanh, 7. Feng X.J, Hove C.E, Mohan R et al. chúng tôi thu được kết quả: không thấy Improved endothelial viability of heart valves sự biến đổi về hình thái đại thể và cấu cryopreserved by a new technique. Eur J trúc vi thể của các nhóm mô van tim sau Cardiothorac Surg. 1992. 6 (5), pp.251-255. bảo quản lạnh 10 tuần ở nhóm bảo quản 8. Croes E.A, Duijn C.M et al. Review: Variant có huyết thanh và không có huyết thanh Creutzfeldt-Jakob disease. European Journal và so với nhóm chứng. of Epidemiology. 2003, 18 (6), pp.473-477. 172