Cấu trúc siêu vi của tế bào gốc trung mô não giữa chuột cống trắng nuôi cấy

Nội dung text: Cấu trúc siêu vi của tế bào gốc trung mô não giữa chuột cống trắng nuôi cấy

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 CẤU TRÚC SIÊU VI CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ NÃO GIỮA CHUỘT CỐNG TRẮNG NUÔI CẤY Nguyễn Thanh Hoa*; Nguyễn Thị Bình* Nguyễn Phúc Hoàn*; Nguyễn Mạnh Hà* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá cấu trúc siêu vi của tế bào gốc (TBG) trung mô não giữa chuột cống trắng trước và sau nuôi cấy. Đối tượng và phương pháp: phẫu tích lấy mô sàn não giữa phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi, tạo thành dịch treo tế bào (TB) và nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12 có bổ sung các yếu tố tăng trưởng, kháng sinh và kháng nấm trong tủ 370C và 5% CO2. Sau 6 - 8 ngày nuôi cấy, các TB tăng sinh nhanh phủ kín phiến nuôi cấy. Làm tiêu bản hiển vi điện tử và quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét và xuyên. Kết quả: các nơ ron có cấu trúc siêu vi điển hình với đầy đủ bào quan trong bào tương. Các nhánh của nơ ron dài và tạo liên kết synap với các nơ ron khác. Kết luận: nuôi cấy làm tăng sinh và trưởng thành các TB của mô sàn não giữa. * Từ khóa: Sàn não giữa; Nuôi cấy tăng sinh; Biệt hoá; Cấu trúc siêu vi. Ultrastructure of Rat Embryonic Ventral Mesencephalic Precursor Cells in Culture Summary Objectives: To investigate ultrastructure of rat ventral mesencephalic precursor cells before and after culture. Subjects and methods: Dissected the ventral mesencephalon of rat embryos on day 12.5 - 13.5, then created cell suspension and expansion cultured in DMEM/F12 medium supplemented with growth factors, antibiotics, antifungal. After 6 - 8 days of culture, precursor cells proliferated quickly to completely cover culture disk. Samples were prepared and observed under the scanning and transmission electronmicroscope. Results: Neurons contained particular ultrastrutures with many organelles, elongated processes and synaptic contact with another neurons. Conclusion: Ventral midbrain precursor cells cultures were proliferative and differentiated into neurons after 6 - 8 days. * Keywords: Vetral mesencephalon; Proliferation; Differentiation; Ultrastruture. ĐẶT VẤN ĐỀ liềm đen ở não. Bệnh Parkinson có nhiều phương pháp điều trị. Hiện nay, việc ứng Parkinson là một bệnh thoái hóa thần dụng công nghệ TBG vào điều trị là một kinh phổ biến thứ hai sau bệnh Alzheimer, phương pháp mang lại nhiều triển vọng đặc trưng bởi sự thoái hóa các TB thần mới cho bệnh Parkinson. Phương pháp kinh tiết dopamin trên con đường thể vân - này có nhiều ưu điểm vượt trội vì không chỉ 213
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Bình (nguyenthibinh_mp@yahoo.com.vn) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 27/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017 cải thiện được các triệu chứng lâm sàng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP của bệnh, mà còn làm ngừng tiến triển bệnh. NGHIÊN CỨU Các TBG ngoại bì thần kinh bào thai khi 1. Đối tƣợng nghiên cứu. ghép vào thể vân sẽ biệt hóa thành TB - 10 mẫu mô sàn não giữa phôi chuột sản xuất dopamin, tạo ra các synap với cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi. TB thần kinh của người bệnh [3]. Các nơ - 10 mẫu TBG trung mô sàn não giữa phôi ron tiết dopamin chỉ chiếm khoảng 1% tổng chuột cống trắng sau nuôi cấy 6 - 8 ngày. số nơ ron trong n o, nhưng đóng vai trò quan trọng trong nhiều chức năng của não 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. như vận động tự chủ, giải phóng hormon - Tạo phôi chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi thần kinh nội tiết, nhận thức, điều khiển (20 phôi). hành vi cảm xúc, stress và trí nhớ. Khi số lượng các TB thần kinh này bị giảm sút sẽ - Phẫu tích lấy sàn não giữa (20 mảnh). dẫn đến nhiều rối loạn thần kinh nghiêm - Dùng Dispase II , trypsin - EDTA và lực trọng, nổi bật nhất là bệnh Parkinson [4]. cơ học để tạo dịch treo TB (10 mẫu). Ở người, số lượng TB thần kinh tiết dopamin - Nuôi cấy trong môi trường cơ bản: rất ít, chỉ khoảng 400.000. DMEM/F12 có bổ sung thêm các yếu tố Ở động vật có vú, các TB tiết dopamin tăng trưởng, kháng sinh, kháng nấm. được phân chia thành 9 nhóm, nằm rải - Cấy TBG ngoại bì thần kinh não giữa rác từ não giữa tới hành khứu. Theo 4 2 Nguyễn Thanh Hoa và CS (2015), sàn phôi chuột với mật độ 1,5 x 10 cm trên não giữa phôi chuột cống trắng là nơi tập giếng nuôi cấy hoặc trong chai flask, trong 0 trung nhiều TB tiết dopamin [2]. Mỗi lần tủ ấm 37 C, 5% CO2. ghép để điều trị Parkinson cần tới 40.000 - Thay môi trường mỗi 2 ngày/lần, đồng TBG ngoại bì thần kinh não giữa và để có thời đánh giá sự phát triển của TB bằng được số lượng TB này cần tới 4 não giữa kính hiển vi soi nổi. phôi [5, 6]. Vì vậy, nuôi cấy để tăng sinh - Các mảnh mô sàn não giữa và mẫu TB số lượng nơ ron nói chung và số lượng nuôi cấy được làm tiêu bản hiển vi điện tử: nơ ron tiết dopamin là cần thiết. Các TB của sàn não giữa sẽ thay đổi thế nào sau + Cố định bằng glutarandehyt 2,5%/ khi nuôi cấy in vitro?. Để trả lời câu hỏi này, cacodylate 0,1 M, pH 7,2 - 7,4 qua đêm chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm: ở 40C. - Nghiên cứu cấu trúc siêu vi của mô + Rửa mẫu bằng dung dịch cacodylate sàn não giữa phôi chuột cống trắng. 0,1 M (15 phút/lần x 3 lần). - Nghiên cứu cấu trúc siêu vi của TB + Cố định axít osmic 1%/cacodylate sàn não giữa phôi chuột cống trắng sau 0,1 M trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. nuôi cấy in vitro. + Rửa mẫu bằng cacodylate 0,1 M 15 phút x 3 lần. 180
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 + Kính hiển vi điện tử xuyên: khử nước, - Chỉ tiêu nghiên cứu: hình thái siêu cấu đúc block, cắt lát mỏng 30 - 40 nm, nhuộm trúc của TB và bào quan trước và sau nuôi bằng uranyl acetate trong 10 phút và citrate cấy. chì trong 5 phút. + Kính hiển vi điện tử quét: khử nước, phủ vàng. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Cấu trúc siêu vi sàn não giữa phôi chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi. A B C D Hình 1: Sàn não giữa phôi chuột cống trắng 12,5 -13,5 ngày tuổi. (Ty thể (Mi), lưới nội bào có hạt (RER), đám glycogen (Gl), bộ golgi (Gol), nhân TB (Nu)) Các TB nằm sát nhau dạng biểu mô (hình 1A). Tỷ lệ nhân/bào tương của TB cao. Trong bào tương của TB, số lượng bào quan và chất vùi tăng r rệt: lưới nội bào có hạt dài, lòng rộng, mặt ngoài ít ribosom bám; ty thể nhiều và đa dạng; bộ golgi điển hình; glycogen tập trung thành những đám khá lớn (hình 1B, C). Một số TB có hình thái của TBG với nhân lớn, trong bào tương ít bào quan (hình 1D). 215
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Hình 2: Các nhánh bào tương của nơ ron sàn n o giữa phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi. (Ty thể (Mi), lưới nội bào có hạt (RER), nhánh bào tương (*)) Các TB biệt hóa thành nơ ron có nhánh bào tương. Trong các nhánh có nhiều tơ thần kinh và một số bào quan như lưới nội bào có hạt và ty thể. Một số nhánh bào tương có phần tận cùng phình to và tiếp xúc với TB khác. Tuy nhiên, chưa quan sát thấy hình ảnh tạo synap giữa các TB (hình 2A, B, C). 2. Siêu cấu trúc của TB sàn não giữa chuột cống trắng sau nuôi cấy 6 - 8 ngày. 216
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Hình 3: TB mô sàn não giữa nuôi cấy 6 ngày. (A: liên kết giữa các nơ ron; B: các nhánh bào tương (*); C: nón tăng trưởng (*); D: synap giữa các nơ ron; E: bào tương của nơ ron; F: nguyên bào thần kinh; Ty thể (Mi), lưới nội bào có hạt (RER), nhân TB (Nu)) Các nơ ron liên kết với nhau chằng chịt nguyên bào thần kinh đệm nằm ở lớp áo. (hình 3A). Nhánh bào tương của nơ ron Các TBG ngoại bì thần kinh ở não giữa rất nhiều và rất dài (hình 3B). Đầu của các bắt đầu phát triển, tăng sinh và biệt hóa nhánh phình to, tiếp xúc với nơ ron khác bằng sự xuất hiện TB thần kinh xuyên (hình 3C). Nhiều chỗ đ hình thành các tâm. Nhiều nghiên cứu cho thấy: chính synap với cấu trúc điển hình (hình 3D). những TB này biệt hóa thành nơ ron tiết dopamin sau này [7, 8, 9]. Ở thời điểm Trong bào tương, lưới nội bào có hạt phôi 12,5 - 13,5 ngày tuổi, trong sàn não phát triển, thành có nhiều ribosom bám giữa các TB đứng sát nhau. Trong bào (hình 3E). Một số TB còn giữ tính gốc với tương TB, bào quan như lưới nội bào, biểu hiện nhân to, bào tương ít bào quan ty thể, bộ golgi phát triển. Xen giữa các (hình 3F). TB có nhánh bào tương trong có xơ thần kinh. Theo Sturrock R.R (1982), đây là những BÀN LUẬN nhánh bào tương của TB thần kinh đệm Trong quá trình phát triển phôi thai, khi hoặc là một giai đoạn phát triển sợi trục máng thần kinh mới khép thành ống thần của nơ ron [10]. Có những nhánh bào kinh là biểu mô gồm một hàng TB gọi là tương có đầu tận cùng phình to và tiếp biểu mô thần kinh. Ở não giữa, thành não xúc với nhánh hoặc thân TB khác. Đây dày lên do tăng sinh mạnh các TB biểu chính là hình ảnh của nón tăng trưởng. mô làm thành ống có dạng biểu mô trụ Điều này chứng tỏ, ở sàn não giữa phôi giả tầng, gồm 2 loại TB là nguyên bào chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi các TB đ xốp và nguyên bào thần kinh. Các nguyên di cư. Tuy nhiên, khi quan sát dưới kính bào thần kinh sẽ di cư ra vùng ngoại vi hiển vi điện tử, chúng tôi chưa thấy tạo của thành ống thần kinh. Sự di cư, biệt synap giữa các TB trong thành não giữa, hóa của những TB này chia thành ống như vậy quá trình biệt hóa thành các nơ ron thành 3 lớp: lớp nội tủy, lớp áo và lớp chưa kết thúc. màn rìa. Những nguyên bào thần kinh và 217
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Khi tiến hành nuôi cấy, chúng tôi dùng TÀI LIỆU THAM KHẢO enzym và tác động cơ học để ly giải mô 1. Nguyễn Văn Chương. Bệnh học thần sàn não giữa thành dịch treo TB. Trong kinh. NXB Y học. Hà Nội. 2011. dịch treo gồm hỗn hợp các loại TB ở 2. Nguyễn Thanh Hoa, Nguyễn Thị Bình, dạng gốc và đang phát triển ở những giai Nguyễn Mạnh Hà. Biến đổi siêu cấu trúc não đoạn khác nhau. Sau nuôi cấy 6 - 8 ngày, giữa phôi chuột cống trắng 10,5 - 13,5 ngày TB tăng sinh nhanh chóng. Trong chai tuổi. Tạp chí Y học Việt Nam. 2015, 1 (433), nuôi cấy, chúng tôi thấy có những đám tr.35-39. TB dạng biểu mô, TB ít nhánh, TB sao và 3. Brundin P, Kordower J.H. Neuropathology nơ ron. Theo thời gian, các nơ ron xuất in transplants in Parkinson’s disease: hiện càng nhiều, nhánh dài và liên kết với Implications for disease pathogenesis and the future of cell therapy. Prog Brain Res. 2012, nhau chằng chịt khi quan sát dưới kính 200, pp.221-241. hiển điện tử quét. Trên các lát cắt siêu vi 4. Chinta S.J, Andersen J.K. Dopaminergic của mẫu nuôi cấy, chúng tôi thấy nơ ron neurons. The International Journal of đang phát triển ở các giai đoạn khác nhau: Biochemistry & Cell Biology. 2005, 37 (5), có nơ ron giữ nguyên tính gốc, có nơ ron pp.942-946. có nhánh ngắn, có nơ ron với các nhánh 5. Olanow C.W, Goetz C.G, Kordower J.H, tạo thành nón tăng trưởng. Đặc biệt, Stoessl A.J, Sossi V et al. A double-blind chúng tôi đ quan sát thấy synap tạo controlled trial of bilateral fetal nigral thành giữa các nơ ron. Như vậy, sau 6 - 8 transplantation in Parkinson’s disease. Ann ngày nuôi cấy đ xuất hiện những nơ ron Neurol. 2003, 54, pp.403-414. được biệt hóa hoàn toàn. Trong số các 6. Lindvall O, Bjorklund A. Cell Therapeutics nơ ron này có những nơ ron dương tính in Parkinson’s Disease. Neurotherapeutics. 2011. với marker TH, là marker đặc hiệu cho TB 7. Ono Y, Nakatani T, Sakamoto Y et al. Differences in neurogenic potential in floor thần kinh tiết dopamin. Điều này chứng tỏ plate cells along an anteroposterior location: một số TBG đ được biệt hoá thành các midbrain dopaminergic neurons originate from nơ ron tiết dopamin sau nuôi cấy. mesencephalic floor plate cells. Development. KẾT LUẬN 2007, 134 (17), pp.3213-3225. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử, 8. Shults C.W, Hashimoto R, Brady R.M chúng tôi nhận thấy: et al. Dopaminergic cells align along radial glia in the developing mesencephalon of the - Các TB sàn não giữa phôi chuột cống rat. Neuroscience. 1990, 38 (2), pp.427-436. trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi đ bắt đầu di cư 9. Hebsgaard J.B, Nelander J, Sabelstrom và biệt hóa, nhưng sự biệt hóa các nơ ron H et al. Dopamine neuron precursors within chưa hoàn toàn. the developing human mesencephalon show - Nuôi cấy in vitro làm tăng sinh và radial glial characteristics. Glia. 2009, 57 (15), trưởng thành các TB mô sàn não giữa chuột pp.1648-1658. cống trắng. 10. Sturrock R.R. A scanning and transmission electron microscopic study of the embryonic 218