Cập nhật kết quả nuôi cấy tinh tử tại trung tâm công nghệ phôi - Học viện quân y

Nội dung text: Cập nhật kết quả nuôi cấy tinh tử tại trung tâm công nghệ phôi - Học viện quân y

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 CẬP NH ẬT K ẾT QU Ả NUÔI C ẤY TINH T Ử TẠI TRUNG TÂM CÔNG NGH Ệ PHÔI - H ỌC VI ỆN QUÂN Y Tr ịnh Qu ốc Thành*; Qu ản Hoàng Lâm*; Nguy ễn Đình T ảo* TÓM T ẮT Vô sinh nam gi ới chi ếm kho ảng 50%, do v ậy, r ất c ần thi ết ph ải có ph ươ ng pháp điều tr ị thích h ợp. Trong b ối c ảnh ấy, nuôi c ấy t ế bào dòng tinh đã m ở ra m ột tri ển v ọng trong điều tr ị vô sinh nam gi ới. Đối t ượng và ph ươ ng pháp: kh ảo sát 60 ca nuôi c ấy nuôi c ấy tinh t ử t ừ 2010 - 2015 và làm th ụ tinh ống nghi ệm. Kết qu ả: bệnh nhân (BN) có tinh hoàn bé h ơn bình th ường (9,75 ml so v ới 15 - 20 ml), n ội ti ết t ố ch ưa có s ự thay đổi đáng k ể (FSH: 9,58 mIU/ml so với 5 - 20; LH: 6,45 mIU/ml so v ới 5 - 20; testosteron: 4,45 ng/ml so v ới 3 - 10 ng/ml). T ại th ời điểm 24 và 48 gi ờ sau nuôi c ấy, các t ế bào tinh t ử (tinh t ử tròn, tinh t ử đang kéo dài, tinh t ử đã kéo dài và tinh trùng) đã thay đổi đáng k ể. Đặc bi ệt, tinh t ử đang kéo dài, tinh t ử đã kéo dài và tinh trùng t ăng lên 1,8 - 5 l ần. Kết lu ận: kh ả n ăng th ụ tinh c ủa tinh t ử và tinh trùng sau nuôi c ấy đạt 59,81%. T ỷ l ệ có thai sau chuy ển phôi 26,66%. * T ừ khóa: Vô sinh nam gi ới; Nuôi c ấy tinh t ử; Phôi. Update Results of Sperm Culture at Embyro Technology Center, Military Medical University Summary Male infertility accounted for approximately 50%, thereby it is necessary to have appropriate treatment. On a basis, germ cell line culture has opened up a prospect in the treatment of male infertility. Subjects and methods: A survey of 60 cases of spermid were cultured from 2010 to 2015 for IVF. Results: Testicles were smaller than usual (9.75 ml versus 15 - 20 ml), the hormone had no significant change (FSH: 9.58 mIU/ml versus 5 - 20; LH: 6,45 mIU/ml versus 5 - 20; testosterone: 4,45 ng/ml versus 3 - 10). At the time 24 and 48 hours of incubation, germ cell line (round spermid, prolonged spermid and sperm) had a dramatical change. Especially, prolonging spermid, prolonged spermid and sperm increased from 1.8 to 5 times. Conclusions: The ability of spermid and sperm fertilization after incubation reached 59.81%. Pregnancy rate following embryo transfer was 26.66%. * Key words: Male infertilty; Sperm culture; Embryo. ĐẶT V ẤN ĐỀ các t ế bào dòng tinh b ị ng ưng tr ệ (maturation Ngày nay ng ười ta bi ết r ằng vô tinh arest) ở m ột giai đoạn nào đó mà không (azoospermia) không do t ắc (non-obstructive bi ệt hóa phát tri ển đến tinh trùng. Nguyên azoospermia) th ường do r ối lo ạn quá trình nhân c ủa quá trình này hi ện ch ưa được sinh tinh. Trong nh ững tr ường h ợp này, làm rõ. Vấn đề càng tr ở nên khó kh ăn khi * Học vi ện Quân y Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Tr ịnh Qu ốc Thành (thanhan1828@yahoo.com.vn) Ngày nh ận bài: 20/05/2016; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 06/07/2016 Ngày bài báo được đă ng: 22/07/2016 7
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 quá trình bi ệt hóa không đến giai đoạn mầm phân tá n hay t ập trung [6], hay đượ c cu ối cùng, t ức là không sinh ra tinh trùng phân l ập và là m sạ ch tr ướ c khi nuôi c ấy ở các ống sinh tinh. Ở nhóm BN này, t ế bào ho ặc đồng nuôi c ấy cùng v ới vi ệc phá t dòng tinh chỉ bi ệt hóa và d ừng l ại ở tinh tri ển cá c công cụ thi ết y ếu để theo d õi t ốt bào I, tinh bào II hay tinh t ử mà không hơn cá c t ế bà o dò ng tinh tr ưở ng thà nh đến tinh trùng [1]. Do đó, vi ệc kích thích cũng nh ư phân tí ch m ối liên quan gi ữa t ế các t ế bào dòng tinh bi ệt hóa đầy đủ đến bà o Sertoli và tế bà o m ầm [6]. Đặc bi ệt, giai đoạn tinh t ử hay tinh trùng có m ột ý nuôi c ấy t ế bà o Sertoli v ới cá c đám nhỏ tế ngh ĩa vô cùng quan tr ọng trong th ụ tinh, bà o dò ng tinh. Rosalia Sa 2008 [10] đề trên c ơ s ở đó góp ph ần gi ải quy ết v ấn đề xu ất quy trình nuôi c ấy t ế bào Sertoli - t ế bà o vô sinh nam do vô sinh. mầm nh ư sau: (1) dùng enzym tá ch c ấu trúc Hi ện nay, nuôi c ấy tinh t ử nh ằm bi ệt trung gian gi ữa t ế bào Sertoli và tế bà o m ầm hóa tinh t ử tròn thành tinh t ử đã kéo dài càng ít càng t ốt; (2) t ập h ợp các đám l ớn ho ặc tinh trùng là m ột v ấn đề m ới và có mật độ t ế bà o Sertoli để gi ữ tr ạng thái liên nhu c ầu l ớn t ừ BN. Trên c ơ s ở đó, chúng kết; (3) sử dụ ng môi tr ườ ng hó a họ c xá c tôi cập nh ập k ết qu ả nuôi c ấy tinh t ử t ại định b ổ sung hormon (testosteron, FSH, Trung tâm Công ngh ệ Phôi - H ọc vi ện các y ếu t ố phá t tri ển); (4) thường xuyên Quân y nh ằm tìm hi ểu: Kh ả n ăng bi ệt hóa của tinh t ử tròn thành tinh t ử kéo dài, tinh thay đổi môi tr ường nuôi c ấy. trùng c ũng nh ư kh ả n ăng th ụ tinh c ủa tinh Kết qu ả cho th ấy tinh t ử trò n có th ể mọc tử sau nuôi c ấy và t ỷ l ệ có thai sau th ụ đuôi trong môi tr ườ ng nuôi c ấy. Các liên k ết tinh ống nghi ệm. gi ữa t ế bào Sertoli và t ế bào dòng tinh c ũng Kỹ thu ật nuôi c ấy t ế bào dòng tinh g ần được hình thành trong quá trình nuôi c ấy. đây có nhi ều ti ến b ộ, v ới cá c h ệ th ống Sự có m ặt c ủa các liên k ết g ợi ý t ế bào dòng nuôi c ấy ph ức tạ p, g ồm nuôi c ấy t ế bà o tinh có th ể chuy ển hóa cùng v ới t ế bào Sertoli. Hình 1: Nuôi c ấy các t ế bào dòng tinh v ới t ế bào Sertoli [10]. (A: tách các t ế bào dòng tinh (ST: ống sinh tinh); B, C, D, E, F: t ế bào Sertoli v ới t ế bào dòng tinh (SC: t ế bào Sertoli; n, nc, L: nhân, h ạt nhân, gi ọt lipid c ủa t ế bào Sertoli); ST1: tinh bào I; e: h ồng c ầu. 8
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 Nhìn chung, các nghiên c ứu v ề nuôi c ấy thanh bào thai bê 10%, kháng sinh penicillin quá trình sinh tinh m ới được th ực hi ện 100 IU/ml, FSH 50 mIU/ml, testosteron gần đây, trên c ơ s ở c ấy ghép m ảnh tinh 1 µmol/ml. hoàn và đồng nuôi c ấy gi ữa t ế bào Sertoli - Ki ểm tra các lo ại t ế bào dòng tinh và với t ế bào dòng tinh [10], đặc bi ệt nuôi c ấy tế bào Sertoli theo Sousa (2002), trên kính lập th ể [4]. Hoffman th ời điểm 0 gi ờ. Nhi ệt độ 32 0C, ĐỐI T ƯỢNG VÀ PH ƯƠ NG PHÁP 5% CO 2. NGHIÊN C ỨU - Ti ến hành đồng nuôi c ấy gi ữa t ế bào 1. Đối t ượng nghiên c ứu. Sertoli v ới tế bào dòng tinh. 60 c ặp v ợ ch ồng vô sinh được xác định - Th ời gian nuôi c ấy: 24 gi ờ, 48 gi ờ. nguyên nhân do ch ồng vô sinh đủ tiêu chu ẩn - Nh ững tr ường h ợp IVF/ICSI v ới tinh được l ựa ch ọn, sau đó chu ẩn b ị h ồ s ơ IVF; trùng nuôi c ấy, BN được chu ẩn b ị nuôi sử d ụng phác đồ IVF thông d ụng phù h ợp cho ng ười v ợ, k ết h ợp v ới nuôi c ấy tinh cấy tr ước 24 gi ờ, sau đó ch ọc noãn, ti ến tử để làm th ụ tinh trong ống nghi ệm. hành k ỹ thu ật tiêm tinh trùng vào bào BN đủ tiêu chu ẩn l ựa được th ực hi ện tươ ng noãn (ICSI) v ới tinh trùng được l ựa nghiên c ứu t ừ 1 - 2010 đến 12 - 2015 ch ọn. Đánh giá quá trình th ụ tinh c ủa noãn tại Trung tâm Công ngh ệ Phôi, H ọc vi ện qua hình thái h ợp t ử và phôi ở các th ời Quân y. điểm ngà y th ứ 1 (N1), ngà y th ứ 2 (N2) và 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. ngà y th ứ 3 (N3) theo Lynette Scott (2000) và Andres Salumet (2001). Sinh thi ết tinh hoàn theo ASRM (1999) [3]. - Nh ập và x ử lý s ố li ệu nghiên c ứu b ằng * X ử lý m ẫu mô tinh hoàn chu ẩn b ị ch ươ ng trình STATA 10.0. nuôi c ấy: - Dụng c ụ, hóa ch ất (men collagenaza KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU VÀ týp IV, kháng sinh penicilin, puregon BÀN LU ẬN (organon), testosteron soluble, huy ết thanh 1. Th ể tí ch trung bì nh tinh hoàn bào thai bê (FCS-Sigma), môi tr ường của BN. Gamete, IVF (Vitrolife) Ph ươ ng ti ện (t ủ hood, t ủ ấm có 5% CO 2, kính hi ển vi đảo Bảng 1: ng ược, máy ly tâm, máy l ắc...). Th ể tích Th ể tích tinh - Kỹ thu ật ti ến hành: nghi ền nh ẹ m ẫu tinh hoàn hoàn bình p mô tinh hoàn b ằng 2 lam kính, hút d ịch BN (ml) th ường (ml) nghi ền cho vào ống 5 ml, thêm collagenaza Trung bình (X ± SD) 9,75 ± 3,14 15 - 20 < 0,01 (n ồng độ 1.000 IU/ml), cho máy l ắc trong Giá tr ị min, max 5 - 16 30 phút để tách hoàn toàn các t ế bào ở mô tinh hoàn. Ly tâm 2 l ần, 600 vòng/phút So v ới th ể tích tinh hoàn trung bình trong 5 phút, l ấy c ặn l ắng thêm vào v ừa của ng ười Vi ệt Nam trong điều tra c ủa đủ 1 ml môi tr ường gamete. Thêm huy ết Nguy ễn Thành Nh ư (2007) là 15 - 20 ml, 9
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 tinh hoàn ở nhóm BN vô tinh khá nh ỏ (p < Tại các th ời điểm nuôi c ấy 24 và 48 gi ờ, 0,01). Điều này cho th ấy t ế bào dòng tinh số l ượng tinh t ử tròn gi ảm. M ặc dù gi ảm gi ảm sút nghiêm tr ọng. B ất k ể lý do gì, s ố ch ưa có ý ngh ĩa th ống kê, tuy nhiên, t ại th ời lượng các t ế bào dòng tinh gi ảm sút s ẽ điểm 24 gi ờ, s ố l ượng tinh t ử tròn gi ảm làm th ể tích tinh hoàn bé l ại. 1,53 l ần, t ại th ời điểm 48 gi ờ gi ảm 2 l ần. 2. N ồng độ n ội ti ết t ố c ủa BN. Số l ượng tinh t ử tròn gi ảm sau nuôi Bảng 2: N ồng độ hormon c ủa BN. cấy m ột ph ần hao h ụt do thoái hóa ho ại tử trong quá trình x ử lý m ẫu và thay môi FSH Testosteron Nồng độ LH (mIU/ml) (mIU/ml) (ng/ml) tr ường nuôi c ấy. Nh ưng ph ần l ớn do tinh tử tròn đã b ước vào quá trình bi ệt hóa Ch ỉ s ố BN 9,58 ± 7,81 6,45 ± 2,71 4,45 ± 2,31 thành tinh t ử đang kéo dài, do quá trình Ch ỉ s ố bình 5 - 20 5 - 20 3 - 10 tự nhiên bi ệt hóa t ừ tinh t ử tròn sang tinh th ường tử đang kéo dài không đòi h ỏi th ời gian p > 0,05 quá lâu. Kết qu ả xét nghi ệm n ội ti ết c ủa BN Kết qu ả này phù h ợp v ới quan sát c ủa “d ường nh ư” trong gi ới h ạn bình th ường Movahedin (2004), Roulet (2006) [9]: ở th ời (FSH, LH: 5 - 20 mIU/ml; testosteron 2 - điểm s ớm c ủa nuôi c ấy, s ố l ượng tinh t ử 10 ng/ml [1]). Tuy nhiên, FSH càng cao, tròn gi ảm xu ống. càng cho th ấy tinh hoàn c ủa BN bị rối * Thay đổi v ề t ỷ l ệ tinh t ử đang kéo dài: lo ạn sinh tinh, c ụ th ể là suy gi ảm quá trình Bảng 4: Thay đổi t ỷ l ệ tinh t ử đang kéo sinh tinh d ẫn đến c ơ ch ế ph ản h ồi ng ược, dài tr ước và sau nuôi c ấy. tuy ến yên t ăng ti ết FSH để thúc đẩy quá Tinh t ử đang kéo dài p trình sinh tinh. Th ời điểm (X ± SD, %) Nh ư v ậy, n ồng độ hormon thay đổi ở BN 0 gi ờ (1) 6,15 ± 4,19 p2.1 > 0,05 p3.2 > 0,05 trong nghiên c ứu này ch ưa rõ nét, đặc bi ệt 24 gi ờ (2) 11,78 ± 4,67 testosteron và LH. Ngo ại tr ừ FSH t ăng có p3.1 < 0,05 48 gi ờ (3) 13,12 ± 5,57 giá tr ị cho tiên l ượng trong lâm sàng. 3. K ết qu ả nuôi c ấy các t ế bào tinh t ử. Sau 24 và 48 gi ờ nuôi c ấy, s ố l ượng tinh tử đang kéo dài (Sb, Sc) t ăng lên m ột * Thay đổi v ề t ỷ lệ tinh t ử tròn: cách đáng k ể, tuy ch ưa có ý ngh ĩa th ống Bảng 3: Thay đổi t ỷ l ệ tinh t ử tròn tr ước kê nh ưng v ới m ức t ăng 1,9 và 2,15 l ần thì và sau nuôi c ấy. đây c ũng là m ột trong nh ững thành công Tinh t ử tròn của m ục tiêu nuôi c ấy. Th ời điểm p (X ± SD, %) Kết qu ả này phù h ợp v ới quan sát c ủa 0 gi ờ (1) 17,91 ± 4,42 p2.1 > 0,05 Gerton (1984), Aslam (1998) [2] và Movahedin p3.2 > 0,05 24 gi ờ (2) 12,75 ± 4,18 (2004), cho th ấy nuôi c ấy ở th ời điểm p3.1 > 0,05 sớm, s ố l ượng tinh t ử đang kéo dài t ăng 48 gi ờ (3) 9,23 ± 4,53 lên. 10
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 * Thay đổi v ề t ỷ l ệ tinh t ử đã kéo dài: bổ sung thêm n ội ti ết đầy đủ, nuôi c ấy Bảng 5: Thay đổi t ỷ l ệ tinh t ử đã kéo dài trong điều ki ện thu ận l ợi. Pha cu ối c ủa tr ước và sau nuôi c ấy. quá trình bi ệt hóa t ừ tinh t ử đã kéo dài thành tinh trùng c ũng không quá ph ức t ạp. Th ời điểm Tinh t ử đã kéo dài p (X ± SD, %) * Kh ả n ăng th ụ tinh c ủa tinh t ử, tinh trùng 0 gi ờ (1) 3,59 ± 0,71 thu được sau nuôi c ấy: 24 gi ờ (2) 6,49 ± 6,33 p2.1 > 0,05 Bảng 7: Kh ả n ăng th ụ tinh c ủa tinh t ử p3.2 > 0,05 sau nuôi c ấy. 48 gi ờ (3) 8,92 ± 7,45 p < 0,05 3.1 Số noãn Số noãn S ố noãn không Sau nuôi c ấy 24 và 48 gi ờ, s ố l ượng thu được th ụ tinh (%) th ụ tinh (%) tinh t ử đã kéo dài (Sd) t ăng lên m ột cách 428 256 (59,81%) 172 (40,19) đáng k ể, tuy ch ưa có ý ngh ĩa th ống kê Chúng ta th ấy t ỷ l ệ th ụ tinh của tinh t ử nh ưng đã t ăng lên 1,8 và 2,4 l ần. Đây chính và tinh trùng sau nuôi c ấy không quá là m ột trong nh ững thành công c ủa m ục chênh l ệch so v ới v ới t ỷ l ệ IVF/ICSI thông tiêu nuôi c ấy. th ường [8]. Kết qu ả này phù h ợp v ới quan sát c ủa Mặc dù các tinh t ử, tinh trùng được Movahedin (2004): nuôi c ấy ở th ời điểm nuôi c ấy, nh ưng mức độ bi ệt hóa, tr ưởng sớm, s ố l ượng tinh t ử đã kéo dài t ăng lên. thành và kh ả n ăng th ụ tinh không bằng * Thay đổi v ề t ỷ l ệ tinh trùng: tinh trùng có s ẵn trong ch ỉ định IVF/ICSI Bảng 6: Thay đổi t ỷ l ệ tinh trùng tr ước khác. và sau nuôi c ấy. * T ỷ l ệ có thai: Tinh trùng Có thai Th ời điểm p (X ± SD, %) Không có thai 0 gi ờ (1) 0,75 ± 0,26 p2.1 > 0,05 26.66 24 gi ờ (2) 2,42 ± 0,51 p3.2 > 0,05 p3.1 < 0,05 48 gi ờ (3) 4,23 ± 0,71 T ại th ời điểm nuôi c ấy 24 và 48 gi ờ, t ỷ lệ tinh trùng thu được t ăng lên đáng k ể, 73.34 gấp 3,15 l ần và 5 l ần so v ới th ời điểm 0 gi ờ Bi ểu đồ 1: (p < 0,05). Đây c ũng chính là m ột thành Tỷ l ệ có thai sau chuy ển phôi là ch ỉ s ố công của m ục tiêu nuôi c ấy. sau cùng, quan tr ọng nh ất để đánh giá Theo chúng tôi, t ỷ l ệ tinh trùng t ăng lên tất c ả các bi ện pháp k ỹ thu ật tr ước đó. trong quá trình nuôi c ấy là do quá trình Đặc bi ệt, nghiên c ứu này đánh giá k ết qu ả bi ệt hóa c ủa tinh t ử đã kéo dài ti ếp t ục nuôi c ấy c ủa tinh t ử. K ết qu ả này g ần được hoàn thi ện. Quá trình hoàn thi ện này tươ ng đươ ng v ới t ỷ l ệ có thai IVF/ICSI là nh ờ vào nuôi c ấy t ế bào Sertoli t ốt h ơn, của Matyas (2000), Camus (2006) [5], Kupka môi tr ường giàu ch ất dinh d ưỡng được (2010) [7]. 11
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016 KẾT LU ẬN 3. ASRM . Sperm retrieval for obstructive azoospermia. American Society for Reproductive Cập nh ật v ề nuôi c ấy tinh t ử t ừ 2010 - Medicine. 2008, 90, pp.213-218. 2015 v ới 60 ca nuôi c ấy và làm th ụ tinh 4. Bart TP, K. Gassei and Orwig EK. ống nghi ệm, chúng tôi có m ột s ố k ết lu ận: Spermatogonial stem cell regulation and spermatogenesis. Phil. Trans. R. Soc. B. 2010, - BN có tinh hoàn bé h ơn bình th ường 365, pp.1663-1678. (9,75 ml so v ới 15 - 20 ml), n ội ti ết t ố 5. Camus CT et al . Conventional in-vitro ch ưa có s ự thay đổi đáng k ể (FSH: 9,58 fertilization versus intracytoplasmic sperm mIU/ml so v ới 5 - 20; LH: 6,45 mIU/ml so injection in sibling oocytes from couples with với 5 - 20; testosteron: 4,45 ng/ml so v ới tubal infertility and normozoospermic semen. 3 - 10). Fertil Steril. 2006, pp.115-122. Tại th ời điểm 24 và 48 gi ờ sau nuôi 6. Jégou B, Pineau C, Toppari J. Assisted cấy, t ế bào tinh t ử (tinh t ử tròn, tinh t ử reproductive technology. Cambrdge University đang kéo dài, tinh t ử đã kéo dài và tinh Press. 2002. trùng) thay đổi đáng k ể. Đặc bi ệt, tinh t ử 7. Kuppa M et al . Impact of female and đang kéo dài, tinh t ử đã kéo dài và tinh male obesity on IVF/ICSI: Result of 700.000 trùng t ăng lên 1,8 - 5 l ần. ART-cycles in Germany. Gynecological Endocrinology. Early Online. 2010, pp.1-6. - Kh ả n ăng th ụ tinh c ủa tinh t ử và tinh 8. Lasienë K et al . Morphological criteria of trùng sau nuôi c ấy đạt 59,81%. oocyte quality. Medicina (Kaunas). 2009, 4 5 (7), - T ỷ l ệ có thai sau chuy ển phôi 26,66%. pp.509-515. 9. Roulet V et al . Human testis in organotypic TÀI LI ỆU THAM KH ẢO culture: application for basic or clinical research. Human Reproduction. 2006, 21 (6), pp.1564-1575. 1. Tr ần Quán Anh . B ệnh h ọc gi ới tính nam. 10. Sa R et al . Cytological and expression Nhà xuất b ản Y h ọc. Hà Nội. 2009. studies and quantitative analysis of the temporal 2. Aslam I and Fishel S . Short-term in-vitro and stage-specific effects of follicle-stimulating culture and cryopreservation of spermatogenic hormone and testosterone during cocultures cells used for human in-vitro conception. Human of the normal human seminiferous epithelium. Reproduction. 1998, 13 (3), pp.634-638. Biology of Reproduction. 2008, 79, pp.962-975. 12