Buớc đầu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen các locus str phân tích thể khảm ADN đánh giá tình trạng mọc ghép sau ghép tế bào gốc đồng loài tại viện huyết học truyền máu trung uơng

Nội dung text: Buớc đầu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen các locus str phân tích thể khảm ADN đánh giá tình trạng mọc ghép sau ghép tế bào gốc đồng loài tại viện huyết học truyền máu trung uơng

1. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 BƯíC ĐÇU ỨNG DôNG KY THUËT GI¶I TR×NH Tù GEN C¸C LOCUS STR PH©N TÝCH THÓ KH¶M ADN иNH GI¸ T×NH TR¹NG MäC GHÐP SAU GHÐP tÕ bµo gèc ĐåNG LOµI T¹I VIÖN HUYÕT HO C TRUYÒN M¸U Trung Ư¬ng Lê Xuân Hải* TãM T¾T ADN từ người cho và người nhận trước ghép được khuếch đại bằng kít AmpF/STR Identifiler khuếch đại 15 dấu ấn STR và 1 dấu ấn giới tính. Giải trình tự các dấu ấn này. Căn cứ vào đặc điểm khác biệt giữa các alen STR người cho và người nhận, xác định alen mang thông tin tốt nhất để tính toán mức độ khảm. Để xác định chính xác mức độ khảm, trộn hỗn hợp ADN người cho và người nhận trước ghép theo tỷ lệ xác định từ 0 - 100%, sau đó phân tích tính toán % ADN người cho bằng cách tính % donor peak area (% diện tích đỉnh người cho) rồi dựng đường cong chuẩn tương quan giữa % ADN người cho thực tế và % ADN người cho tính toán. Thông qua đường cong chuẩn này, có thể nội suy kết quả % khảm của mẫu bệnh nhân (BN) sau ghép. Kết quả: bằng k thuật giải trình tự gen các locus STR cho 8 cặp ghép tế bào gốc (TBG) đồng loài, đ xác định được 6 trường hợp khảm hoàn toàn và 2 trường hợp khảm hỗn hợp vào ngày D30 sau ghép. Kết luận: Lần đầu tiên ở Việt Nam, đ áp dụng thành công phương pháp giải trình tự gen để xét nghiệm phân tích tình trạng khảm. Phương pháp này có độ tin cậy, độ chính xác cao, cho phép đánh giá tình trạng mọc ghép/thải ghép ở BN sau ghép tủy/ghép TBG tạo máu đồng loài. * Từ khoá: Tế bào gốc đång loài; Giải trình tự gen; Thể khảm AND. Applying sequence genetic loci STR technique in analysis of DNA chimerism to evaluate status of gemmation after hematopoietic stem cell transplantation at National Hospital of Hematology and Transfusion SUMMARY DNAs from pretransplant recipients and donors were amplified with the AmpF/STR Identifiler kit that contain 15 STR markers and 1 sex marker. The fluorescent PCR products were the fractionated on polyacrylmide gels in an ABI DNA sequencer. Results were analyzed using Genemapper ID 3.2 softwear. We selected the best markers as informative alens which can distinguish donor from recipient. For quantitative analysis of the engraftment, we prepared a mixed chimeric sample by mixing pretransplant recipient and donor DNAs in different ratios to produce a standard curve. * ViÖn HuyÕt häc TruyÒn m¸u TW Ng•êi ph¶n håi (Corresponding): Lª Xu©n H¶i (xuanhaile@gmail.com) Ngµy nhËn bµi: 17/5/2013; Ngµy ph¶n biÖn ®¸nh gi¸ bµi b¸o: 10/6/2013 70
2. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 Ngµy bµi b¸o ®•îc ®¨ng: 21/6/2013 After amplifying the posttransplant recipient DNA, we were able to detect the extent of engraftment by interpolating the percent peak area of the informative alens from this standard curve. Results: We retrospectively analyzed 8 patients who had received allogenic PSCT at D30 post-transplant. At D30, 75% of patients had complete chimerism, 25% of patients only have mix chimerism. Conclusion: It is the firt time such kind of engraftment analysis is established in Vietnam. This method provides an useful tool in assessment of chimerism in posttransplant patients. * Key words: Hematopoietic stem cell transplantation; Short tendem repeat; Chimerism. ĐÆT VÊN ®Ò biệt về hệ kháng nguyên hồng cầu và nhiễm s c thể giới tính chỉ có thể sử dụng trong Ghép TBG tạo máu là một phương pháp các trường hợp người cho và người nhận điều trị mới có thể chữa khỏi nhiều bệnh khác nhóm máu và khác giới. So với những máu lành tính và ác tính [6, 7]. Sự xuất hiện các tế bào người cho trong máu người nhận phương pháp khác, phương pháp phân tích sau ghép đồng loài là một chỉ số quan trọng thể khảm dựa vào sự khác biệt giữa các cho phép tiên lượng khả năng thải ghép, tái dấu ấn ADN đặc trưng cá thể người cho và phát, hoặc bệnh ghép chống chủ [2]. Cho người nhận có ưu thế là sử dụng được cho d chỉ c n một tỷ lệ nhỏ tế bào máu, BN s tất cả các trường hợp ghép TBG tạo máu phải đối mặt với nguy cơ tái phát. Do vậy đồng loài. Phương pháp này chính xác hơn mục tiêu của ghép TBG tạo máu đồng loài các phương pháp khác và hiện đang được là mảnh ghép (tức tế bào người cho) mọc sử dụng làm phương pháp chính trong 100% trong máu người nhận [3]. đánh giá đậu ghép hoặc thải ghép trong Thể khảm trong ghép TBG tạo máu là ghép tủy/TBG tạo máu đồng loài [4]. Nếu tại một trạng thái đặc biệt về miễn dịch và di bất cứ thời điểm nào sau ghép, BN được truyền, đặc trưng bởi sự c ng tồn tại của xét nghiệm máu mà không có ADN người các quần thể tế bào có nguồn gốc từ hai cá bệnh thì BN đó ở dạng thể khảm hoàn toàn thể khác nhau. Các dạng thể khảm trong (complete chimerism - CC) hay mọc ghép ghép TBG tạo máu có thể gặp, bao gồm thể hoàn toàn. Tình trạng khảm hoàn toàn khảm hoàn toàn (mọc ghép hoàn toàn trong được cho là có nguy cơ tái phát thấp và tiên ghép TBG tạo máu) hoặc thể khảm hỗn lượng tốt hơn. Nếu xét nghiệm thấy có cả hợp hay khảm một phần (mọc ghép một ADN người cho và ADN người bệnh thì BN phần hoặc trong trường hợp thải ghép) [5]. đó ở dạng khảm hỗn hợp (mixed chimerism Có nhiều phương pháp khác nhau được sử - MC). Thể khảm hỗn hợp chứng tỏ sự có dụng nhằm xác định dạng thể khảm. Về mặt của cả tế bào người cho và người nhận nguyên lý, các phương pháp này đều phải trong quần thể tế bào quan tâm. Nếu sau dựa vào những điểm khác biệt về miễn dịch ghép theo dõi thấy BN chỉ có MC mà không hoặc di truyền giữa người cho và người nhận. có CC, chứng tỏ kết quả ghép chưa đạt được Trong ghép TBG tạo máu, nhất là ghép từ mọc ghép hoàn toàn, nếu thấy bệnh nhân người cho là anh/chị em c ng huyết thống đạt được CC, sau đó lại xuất hiện MC, chứng thì khác biệt về hệ kháng nguyên HLA ít có tỏ có biểu hiện thải ghép. Như vậy, về thực giá trị trong phân tích thể khảm, các khác hành, xét nghiệm phân tích tình trạng thể 71
3. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 khảm rất có ngh a trong theo dõi tiên tương quan d ng cho tính toán định lượng lượng sau ghép TBG tạo máu đồng loài [4]. theo hàm nội suy. ®èi TƯỢNG Vµ PHƯƠNG PH¸P * Khuếch đại các đoạn STR (Short Tandem Repeat, các đoạn lặp ngẫu nhiên): NGHIªN CỨU Sau khi tách chiết thu được ADN từ các 1. Mẫu máu BN. mẫu, chạy phản ứng PCR khuếch đại ADN Phân tích 16 mẫu ADN trước ghép và 8 bằng bộ kít AmpF/STR® Identifiler® PCR mẫu ADN sau ghép (ngày D30 sau ghép) từ Amplification Kit (Applied Biosystems, M ). 8 cặp BN ghép TBG tạo máu đồng loài từ Kít này cho phép khuếch đại 15 locus STR anh/chị em ruột có ph hợp HLA, điều trị tại và 1 locus gen giới tính. Phản ứng chạy Khoa Ghép TBG, Viện Huyết học Truyền trên máy PCR 9700 (ABI, M ) với chu kỳ máu TW từ tháng 9 - 2012 đến 3 - 2013. 0 0 nhiệt như sau: 95 C: 11 phút, 94 C: 1 phút, Tiến hành phân tích tại Khoa Miễn dịch - Di 0 0 0 59 C: 1 phút x 28 chu kỳ, 72 C: 1 phút, 60 C: truyền và Sinh học phân tử, Viện Huyết học 60 phút. Truyền máu TW và Labo phân tích di truyền, Công ty Gentis. * Điện di mao quản và phân tích: . P á u. Xác định kiểu gen của sản phẩm chạy phản ứng PCR của mẫu nghiên cứu bằng * Chuẩn bị mẫu: phương pháp điện di mao quản trên máy Tách chiết ADN genome bằng kít Quick- giải trình tự gen ABI 3100 (Applied Biosystem, gADN MiniPrep (ZymoResearh, USA). Phân M ). Sau điện di, xử l kết quả thu được tích, đánh giá nồng độ ADN và chất lượng bằng phần mềm Genemapper ID 3.2 để xác ADN sau tách chiết trên máy Nanodrop của định alen của mỗi locus. h ng Quiawel (Anh). * Tính toán hỗn hợp thể khảm: * Chuẩn bị xây dựng đường chuẩn hỗn Tỷ lệ % ADN người cho được tính toán từ hợp khảm ADN: mỗi cặp locus STR mang thông tin. % diện Trước khi định lượng tình trạng mọc mảnh tích đỉnh người cho (% peak area) được ghép trong máu ngoại vi, xây dựng đường tính toán theo công thức sau: % peak area chuẩn bằng cách phân tích các mẫu hỗn = [(AD1+AD2) x 100%]/(AD1+AD2+AR1+AR2), hợp ADN người cho và người nhận theo tỷ ở đây A k hiệu cho diện tích đỉnh, D k lệ đ xác định trước. Để tạo mẫu chuẩn cho hiệu cho các alen người cho, R k hiệu cho từng cặp ghép, chúng tôi trộn các mẫu ADN các alen người nhận (hình 1). Trong trường (10 ng/ul) đ tách của BN và người hiến trước hợp người cho và người nhận c ng có chung ghép theo tỷ lệ khác nhau từ 0 - 100%. Các một số alen, chỉ những alen mang thông tin mẫu này được phân tính giải trình tự locus mới được đưa vào tính toán. Bằng cách nội STR, căn cứ vào đặc điểm khác biệt alen suy diện tích đỉnh của alen mang thông tin STR giữa người cho và người nhận, tính có sử dụng đường chuẩn đ xây dựng, toán xác định tình trạng khảm (% donor). tính toán được tình trạng mọc ghép thể hiện Căn cứ vào % donor tính toán được và % bằng % ADN người cho. donor thực tế (% ADN người cho trong hỗn * Định nghĩa khảm hoàn toàn (CC) và hợp ADN đ chuẩn bị), d ng phần mềm Microsoft Excel để xây dựng đường cong khảm hỗn hợp (MC): 73
4. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 Khảm hoàn toàn (CC) được xác định khi cho và ADN người nhận theo tỷ lệ đ biết) xuất hiện > 95% tế bào tạo máu người cho và d ng tỷ lệ % này v đường cong chuẩn. sau ghép TBG tạo máu đồng loài. Khảm hỗn hợp (MC) được xác định khi có 5 - 95% TBG tạo máu người cho sau ghép TBG tạo máu đồng loài [6]. thùc tÕ (MÉu t¹o dùng) t¹o (MÉu tÕ thùc % ADN ng•êi cho ng•êi ADN % % ADN ng•êi cho tÝnh theo % diÖn tÝch ®Ønh (Peak area) Hình 2: Tương quan % ADN người cho tính theo % diện tích đỉnh của các locus mang thông tin và % ADN thực tế (y = -0,006x2 + 1,730x - 5,472; r2 = 0,995). 2. Tìm các alen STR mang thông tin. Hình 1: Cách tính toán tình trạng khảm hỗn Có rất nhiều tổ hợp alen người cho và hợp. R1 và R2 là tín hiệu alen 1 và 2 của người nhận, tuy nhiên, chỉ có một số tổ hợp người nhận; D1 và D2 là tín hiệu alen 1 và 2 có mang thông tin cần thiết để phát hiện của người cho; A là diện tích đỉnh tín hiệu các alen người cho. Mặc d có một số đặc hiệu. (A) Cách tính khi các alen của cả locus xét về mặt k thuật có mang thông tin, người cho và người nhận có những đỉnh nhưng thực tế chúng không tốt để d ng xác khác nhau. (B) Cách tính trong trường hợp định thể khảm hỗn hợp vì có sự xuất hiện có 2 alen dị hợp tử và có 1 alen c ng có ở của các băng “bóng” tồn tại dưới dạng như người cho và người nhận. 2 băng phụ dọc theo các đỉnh alen chính. Nhìn chung, các băng “bóng” là một băng lặp lại nhỏ hơn đỉnh alen chính và có diện KÕT QU¶ NGHIªN CøU tích nhỏ hơn so với alen chính. Các băng 1. Độ tậ tru , độ í xá và đ ờ “bóng” này có thể gây ảnh hưởng đến việc uẩ . lựa chọn locus mang thông tin. Vì các alen ng n hơn có thể khuếch đại . Đ đ m BN và t u tí hiệu quả hơn alen dài, do đó cần phải kích t m u . hoạt một dải hỗn hợp thể khảm có thể Bảng 1 cho biết một số thông tin cơ bản tương ứng với các mẫu sau ghép gặp trên về 8 BN ghép TBG đồng loài tại Viện Huyết lâm sàng. Pha loãng mẫu ADN để đánh giá học Truyền máu TW từ tháng 9 - 2012 đến độ tương quan, khả năng lặp lại, độ tập trung 3 - 2013. Trong số 8 BN này, 1 BN nam và độ nhạy của STR-PCR trong đánh giá (12,5%) và 7 BN nữ (87,5%); 2 BN được định lượng hỗn hợp thể khảm. Tính toán % ghép khác giới (25%), 6 BN ghép c ng giới diện tích đỉnh người cho ở alen mang thông (75%); 1 BN m c bệnh đái huyết s c tố kịch tin các mẫu tạo dựng (mẫu trộn ADN người phát ban đêm (PNH), 2 BN rối loạn sinh tủy 74
5. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 (MDS), 5 BN bạch cầu cấp d ng tủy (AML). BN ghép có tuổi nhỏ nhất 25, lớn nhất 51. Bảng 1: Đặc điểm BN ghép TBG tạo máu đồng loài. CHÈN ®O¸N TUæI BN PHï HîP GIíI GIíI TI NH TRA NG KH¶M D30 PNH 38 Không Nữ MC (32%) AML 25 không Nữ CC 100% AML 37 Có Nữ CC 97% MDS 34 Có Nữ MC 67% MDS 45 Có Nữ CC 100% AML 36 Có Nam CC 100% AML 51 Có Nữ CC 98% AML 47 có Nữ CC 100% Vào thời điểm ngày 30 sau ghép, 6 BN (75%) đạt tình trạng khảm hoàn toàn, 2 BN (25%) chỉ đạt khảm hỗn hợp, trong đó 1 BN đạt thể khảm 32% và 1 BN đạt 67%. Hình 3: Hình ảnh điện di mao quản phân tích mẫu BN số 2. Các alen phân tích từ phải sang trái là: D3S1358, TH01, D13S317; D16S539; D2S1338. Hàng trên c ng là mẫu ADN người cho trước ghép. Hàng 2 là mẫu ADN BN trước ghép. Hàng 3 là mẫu AND BN ngày 30 sau ghép (D30). Ngày D30 sau ghép, phân tích mẫu máu BN thấy 100% là ADN của người cho, 0% là ADN BN. 75
6. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 Các mẫu máu được tách ADN và khuếch đại marker STR. Hình 2 là hình ảnh phân tích 5 locus STR của 1 BN (BN số 2) trước ghép và ngày 30 sau ghép. Phân tích cho thấy ở BN này, các locus D13S31, D16S539, D2S1338 là những locus mang thông tin. BµN LUËN thông tin. Việc nhân bản đồng thời nhiều locus trong một ống phản ứng cho phép xác Ngày nay, ghép TBG tạo máu là một định được locus mang thông tin. Khi thực phương pháp điều trị có thể cứu sống BN nghiệm pha lo ng mẫu người cho và người m c bệnh máu ác tính hoặc BN suy tủy nhận để xây dựng đường chuẩn, chúng tôi xương. Sau ghép TBG, biểu hiện tái phát nhận thấy, mức 5% có thể tái lập được bằng bệnh là một dấu hiệu thất bại của ca ghép. phương pháp thực nghiệm. Thậm chí, mức Phát hiện sớm tình trạng tái phát có thể < 5% vẫn có thể tìm thấy đỉnh khác biệt. giúp sớm quyết định biện pháp điều trị bổ Ngoài ra, việc phân tích nhiều alen làm tăng sung hiệu quả. Do vậy, với những BN ghép độ tin cậy của kết quả, do làm tăng cơ hội TBG tạo máu đồng loài, cần thiết phải làm đánh giá các đỉnh mang thông tin. Một số xét nghiệm phân tích đậu mảnh ghép sau locus mặc d mang ngh a về mặt k thuật, ghép để khẳng định mảnh ghép đ mọc và nhưng không tốt để xác định tình trạng để phát hiện tình trạng mọc ghép hay tái khảm, vì có sự tồn tại của các dải lặp lại phát sau ghép [5]. (hay “bóng đỉnh”), các dải này chủ yếu xuất Các đặc tính đa hình của ADN được hiện ở dạng 2 đỉnh phụ dọc theo đỉnh alen d ng để theo dõi mọc ghép sau ghép đồng chính. Sự có mặt của các đỉnh lặp lại ảnh loài, không d ng đánh giá tình trạng mọc hưởng đến việc lựa chọn locus mang thông ghép sau ghép tự thân [5]. Trong trường tin d ng để phân tích mọc ghép. Do đó, khi hợp người cho là anh/chị em sinh đôi giống phân tích cần loại bỏ các alen phụ này. nhau về di truyền, các đặc tính đa hình của KÕT LUËN ADN cũng không có giá trị. Tính đa hình có giá trị nhất d ng cho mục đích này là biến Viện Huyết học Truyền máu TW hiện đ thể ở một số trình tự lặp lại nhất định, các tiến hành ghép TBG đồng loài cho một số trình tự lặp lại này được gọi là đoạn lặp mặt bệnh như rối loạn sinh tủy, bệnh bạch ng n ngẫu nhiên (STR) [1]. Locus STR mang cầu cấp d ng tủy, đái huyết s c tố kịch phát thông tin là locus mà ở đó có ít nhất 1 alen ban đêm. Tuổi của BN ghép nhìn chung là trẻ (< 55 tuổi). Kết quả sau ghép có đến 75% người nhận có số lượng đoạn lặp lại khác đạt tình trạng khảm hoàn toàn, 25% đạt tình với alen người cho. Vì người cho và người trạng khảm hỗn hợp. Kết quả này phản ánh nhận thường có quan hệ họ hàng với nhau, chất lượng ghép của Việt Nam ở mức độ nên người cho và người nhận có nhiều alen khá, tương đương trình độ của khu vực. giống nhau. Vì vậy, cần phân tích trên nhiều Với việc phân tích các alen STR, lần đầu locus STR để xác định được ≥ 1 locus mang tiên ở Việt Nam, đ áp dụng thành công 2
7. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 phương pháp sinh học phân tử trong đánh 4. Lobashevsky AL, Senkbeil RW, Townsend giá tình trạng khảm sau ghép TBG đồng JE, Mink CA, Thomas JM. Quantitative analysis loài với độ tin cậy, độ chính xác cao, loại trừ of chimerism using a short tandem repeat method on fluorescent automated ADN sequencer. Clin được những khó khăn trong xác định mọc Lab Haematol. 2006, 28, pp.40-49. ghép ở trường hợp ghép c ng nhóm máu, 5. Ma X, Wu D, Sun A et al. The value of ghép đồng giới. monitoring minimal residual disease in the patients TµI LIÖU THAM KH¶O with donor lymphocyte infusion as intervention of relapse/refractory acute lymphoblastic leukemia 1. Butler JM. Forensic ADN typing: Biology after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. and technology behind STR marker. Academic Am J Hematol. 2010, 85, pp.141-142. Press. London. 2001. 6. Goh RY, Kim SH, Han JY. Lineage-specific 2. Catalin Marian, Andrei Anghel, Simona chimerism analysis in nucleated cells, T cells and Maria Bell, Beatrix Katalin Frencz, Sorin Ursoniu, natural killer cells after myeloablative allogeneic Milan Dressler, Octavian Popescu, Bruce Budowle. hematopoietic stem cell transplantation. Korean STR data for the 15 AmpF/STR Identifiler loci in J Hematol. 2011 Mar, 46 (1), pp.18-23. the Western Romanian population. Forensic Science 7. Weng L, Dyson J, Dazzi F. Low-intensity International. 2007, 170, pp.73-75. transplant regimens facilitate recruitment of 3. Chen DP, Tsao KC, Wang PN, Tseng donor-specific regulatory T cells that promote CP, Sun CF. Quantitative analysis of chimerism hematopoietic engraftment. Proc Natl Acad Sci. after allogeneic peripheral blood stem cell USA. 2007, 104, pp.8415-8420. transplantation. Chang Gung Med J. 2002 Nov, 25 (11), pp.734-742. 77
8. TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 78