Bước đầu nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B bằng phương pháp tiêm ethanol

Nội dung text: Bước đầu nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B bằng phương pháp tiêm ethanol

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIÊM ETHANOL Nguyễn Tuấn Quang*; Phạm Thúy Ngọc** Vũ Thị Hồng Hạnh**; Nguyễn Văn Lâm**; Phạm Thị Minh Huệ** TÓM TẮT Nghiên cứu đã xây dựng quy trình bào chế liposome amphotericin B (AmB) bằng phương pháp tiêm ethanol (pha loãng ethanol). Hoà tan hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC), cholesterol, AmB trong hỗn hợp ethanol và N,N-dimethylacetamid (DMA) ở 60oC, tiêm nhanh dung dịch này vào pha nước với tỷ lệ thể tích khác nhau để tạo liposome. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/nước, nhiệt độ phối hợp 2 pha và tốc độ khuấy trộn 2 pha thông qua các đặc tính về kích thước tiểu phân, độ đồng nhất, hình thái và hiệu suất liposome hóa. Kết quả: đã bào chế được hỗn dịch liposome AmB 50 mg/10 ml có kích thước nhỏ (khoảng 190 nm), đồng nhất (PDI = 0,136), hiệu suất liposome hóa > 70%, cấu trúc đa khoang đa lớp. * Từ khoá: Liposome; Amphotericin B; Phương pháp tiêm ethanol; Bào chế. INITIAL STUDY OF PREPARATION OF THE LYPOSOME AMPHOTERICIN B USING ETHANOL INJECTION METHOD SUMMARY Liposome amphotericin B (AmB) is prepared by the ethanol injection method (diluting ethanol). Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC), cholesterol, amphotericin B are dissolved in the mixture of ethanol and N,N-dymethilacetamid (DMA) at 600C, then this solution is quickly injected into water phase with different volumes to create liposome. An investigation has been made on the effects of the proportion of ethanol phase over water phase, the combining temperature and the stirring speed of the two phases, basing on the characteristics of the subdivision dimension, the homogeneity, the morphology and the percentage of entrapment of AmB. The result is a suspension of liposome AmB 50 mg/10 ml with small dimension (about 190 nm), morphology (PDI = 0.136), percent of entrapment of AmB (above 70%) and multi-cavity, multi-layer structure. * Key words: Liposome; Amphotericin B; Ethanol injection method; Preparation. ĐẶT VẤN ĐỀ điểm nổi bật về khả năng mang thuốc, kiểm soát giải phóng thuốc và khả năng Amphotericin B là một trong những hệ đưa thuốc tới cơ quan đích. Liposome được mang thuốc mới được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nhờ có những ưu * Học viện Quân y ** Đại học Dược Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (dsquang2000@yahoo.com) Ngày nhận bài: 25/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/09/2014 Ngày bài báo được đăng: 23/07/2014 7
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ứng dụng trong điều trị bệnh ký sinh trùng, Theo phương pháp được Batzri và Korn nhiễm khuẩn và điều trị ung thư [1, 4]. mô tả năm 1973, với thành phần lựa chọn AmB là thuốc điều trị nhiễm nấm toàn gồm: AmB 50 mg, HSPC 213 mg, cholesterol thân phổ rộng, được sử dụng từ rất lâu, 84 mg, succrose 900 mg, dinatri succinat chủ yếu dưới dạng tiêm tĩnh mạch trong 27 mg, ethanol tuyệt đối và DMA vđ [3]. Quá trình bào chế theo các bước sau: trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân. Tuy nhiên, hạn chế của dược chất này hầu - Chuẩn bị pha ethanol: hòa tan HSPC và cholesterol vào 5 ml ethanol ở 60oC, như không tan trong nước nên sinh khả điều chỉnh pH bằng axít HCl 2,5N đến pH dụng thấp và thuốc gây nhiều tác dụng 1,0 - 3,0. Hòa tan 50 mg AmB vào 3 ml phụ, đặc biệt là gây độc cho thận. Vì vậy, hçn hợp dùng môi DMA:EtOH (1:1 v/v). việc nghiên cứu dược chất amphotericin B Phối hợp dung dịch AmB vào dung dịch trong liposome nhằm kiểm soát giải phóng phospholipid. Đun cách thuỷ ở 60oC đến dược chất, tăng sinh khả dụng là một vấn khi thu được pha ethanol màu vàng da cam đề rất có ý nghĩa. Bài báo này, chúng tôi trong suốt. trình bày một số kết quả nghiên cứu bước - Chuẩn bị pha nước: đệm dinatri succinat đầu về bào chế liposome AmB bằng 9 mM pH 5 - 6 + sucrose 7,5%. phương pháp tiêm ethanol. - Phối hợp pha ethanol với pha nước: tiêm nhanh pha ethanol vào pha nước, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP khuấy bằng máy khuấy tốc độ cao với tốc NGHIÊN CỨU độ khuấy và nhiệt độ nhất định trong thời 1. Nguyên liệu và thiết bị. gian 10 phút. - Nguyên liệu: AmB, hydrogenated soybean - Lọc tiếp tuyến để cô đặc dung dịch phosphatidylcholin (HSPC), cholesterol, về thể tích 10 ml. Tiếp tục lọc rửa tiếp ethanol, đường sucrose, dinatrisuccinat tuyến bằng 100 ml dung dịch pha nước để thu được hỗn dịch chứa liposome AmB. hexahydrat và các hóa chất khác theo tiêu chuẩn USP hoặc tiêu chuẩn nhà sản xuất. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ Acetonitril, methanol dùng cho HPLC. lệ thể tích pha ethanol/pha nước, nhiệt độ phối hợp 2 pha và tốc độ khuấy trộn 2 pha - Thiết bị: máy đồng nhất hoá Unidrive đến đặc tính của liposome. X1000 (Mỹ), thiết bị lọc tiếp tuyến * Phương pháp đánh giá một số đặc MicroKros Filter Moducles (Mỹ), hệ thống tính của liposome: thiết bị phân tích kích thước Zetasizer - Xác định kích thước tiểu phân (KTTP) nano ZS90 (Anh); hệ thống máy sắc ký và độ đồng nhất: bằng phương pháp tán lỏng hiệu năng cao Waters e2695 (Mỹ), xạ ánh sáng động với thiết bị Zetasizer hệ thống kính điện tử truyền qua JEOL ZS90. Pha loãng hệ phân tán liposome 1010 (Nhật Bản). 100 lần bằng nước cất, tiến hành đo KTTP. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. Đánh giá kết quả thông qua đồ thị phân bố kích thước theo thể tích, Z , chỉ số * Phương pháp bào chế liposome AmB: average đa phân tán (PDI). 8
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 - Xác định hình thái cấu trúc tiểu phân × 4,6 nm; đường kính hạt nhồi 5 µm. Pha bằng phương pháp chụp hiển vi điện tử động: hỗn hợp acetonitril (ACN) và natri truyền qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi EDTA 0,02M (pH 5,0) với tỷ lệ 40:60 (v/v). âm bản. Tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Thể tích tiêm - Xác định hiệu suất liposome hóa: mẫu 20 µl. Detector UV tại bước sóng định lượng AmB trong liposome thô và 405 nm. Hiệu suất liposome hóa (H%) liposome sau lọc tiếp tuyến bằng phương được tính theo công thức: pháp HPLC với điều kiện sắc ký: cột Cosmosil 5C18-MS-II, kích thước cột 250 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Kết qu¶ khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nƣớc tới đặc tính của liposome. Bào chế các mẫu liposome theo quy trình và điều kiện lựa chọn. Cố định nhiệt độ phối hợp 2 pha là 60oC và tốc độ khuấy trộn 3.900 vòng/phút để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước tới đặc tính của liposome. Các mẫu được bào chế với tỷ lệ thể tích ethanol/nước là 4/100, 6/100, 8/100, 10/100, 15/100 và 20/100 (v/v) tương ứng. Bảng 1: Đặc tính của các mẫu liposome theo tỷ lệ thể tích ethanol/nước. ThÓ tÝch pha ThÓ tÝch pha HiÖu suÊt MÉu Zaverage (d.nm) PDI ethanol (ml) n•íc (ml) liposome hãa (%) M4 4 100 235,1 0,120 69,21 M6 6 100 227,7 0,174 68,94 M8 8 100 204,3 0,120 73,53 M10 10 100 157,8 0,222 67,98 M15 15 100 194,2 0,278 Không đánh giá M20 20 100 176,0 0,208 Không đánh giá (a) (b) Hình 1: Phân bố thể tích các công thức có tỷ lệ thể tích ethanol/nước trên 10/100 (a) và dưới 10/100 (b). 9
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 Kết quả cho thấy: các mẫu khảo sát đều 3.900 vòng/phút để khảo sát ảnh hưởng của tạo được liposome với kích thước nhỏ nhiệt độ phối hợp tới đặc tính của liposome. (Zaverage < 300 nm) và tương đối đồng đều Các mẫu được bào chế ở nhiệt độ: 30, 45, (PDI < 0,3). Tuy nhiên, khi đánh giá về phân 60 và 750C. bố KTTP ở hình 1, có sự khác biệt rõ ràng Bảng 2: Đặc tính các mẫu liposome giữa các công thức có tỷ lệ thể tích ethanol được bào chế ở nhiệt độ phối hợp khác nước từ 10/100 trở lên và công thức có tỷ lệ nhau. thể tích pha ethanol/pha nước dưới 10/100. HiÖu suÊt Theo hình 1 (a) công thức với tỷ lệ thể tích NhiÖt ®é Zaverage MÉu phèi hîp PDI lyposome ethanol/nước từ 10/100 trở lên có KTTP lớn (d.nm) (oC) hãa (%) (> 1.000 nm) chiếm đa số thể tích, các tiểu phân có kích thước nhỏ chiếm thể tích không M8-30 30 363,4 0,283 54,89 đáng kể. ë hình 1b, các công thức với tỷ lệ M8-45 45 230,3 0,142 71,02 thể tích pha ethanol/pha nước dưới 10/100, M8-60 60 204,3 0,120 73,53 tiểu phân kích thước nhỏ chiếm đa số, không xuất hiện tiểu phân kích thước lớn M8-75 75 239,3 0,216 67,47 (>1.000 nm). Có sự khác nhau về KTTP và phân bố Về hiệu suất liposome hóa: tiến hành KTTP các mẫu liposome khi bào chế ở nhiệt định lượng và tính hiệu suất liposome hóa độ khác nhau. Mẫu M8-60 cho KTTP nhỏ của các công thức có tỷ lệ thể tích pha nhất và độ đồng nhất cao nhất (Zaverage ethanol/pha nước từ 10/100 trở xuống. Kết 204,3 nm, PDI = 0,12). Trong khi đó, các quả cho thấy các mẫu liposome đều có hiệu mẫu liposome bào chế ở nhiệt độ 30oC và suất liposome hóa khá cao (> 67%). Trong đó, 75oC cho liposome có KTTP và chỉ số PDI công thức M8 cho hiệu suất liposome hóa lớn hơn. Mặc dù sự khác biệt của chỉ số ở cao nhất (73,53%) và công thức M10 cho các mẫu không nhiều, nhưng kết quả này hiệu suất thấp nhất (67,98%). đã chứng minh nhiệt độ chuyển dạng Tc của Kết hợp với tài liệu tham khảo [2, 5], lựa phospholipid HSPC (khoảng 53oC) có liên chọn tỷ lệ thể tích ethanol/nước là 8/100 thu quan đến đặc tính của liposome. Ở nhiệt độ được mẫu có hiệu suất liposome hóa cao thấp (dưới nhiệt độ Tc), phospholipid có cấu nhất để tiếp tục nghiên cứu. trúc gel bền vững, kém linh hoạt nên làm giảm khả năng tạo và tái tạo liposome. Vì 2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ vậy, khi tăng nhiệt độ, mẫu M8-30, M8-45 phối hợp gi÷a 2 pha tới đặc tính của có xu hướng giảm KTTP và tăng độ đồng liposome. nhất. Khi so sánh mẫu M8-75 với mẫu M8- Bào chế mẫu liposome theo quy trình và 60 (ở trên nhiệt độ Tc), KTTP tăng lên và điều kiện lựa chọn. Cố định tỷ lệ thể tích độ đồng nhất có xu hướng giảm xuống. ethanol/nước là 8/100 và tốc độ khuấy trộn 10
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 Điều này cũng phù hợp với tài liệu tham Có sự khác biệt rõ ràng về KTTP và độ khảo [6]: nên bào chế liposome ở nhiệt độ đồng nhất giữa các công thức khi bào chế cao hơn Tc của phospholipid, nhưng cũng với tốc độ khuấy trộn khác nhau. Công thức không nên bào chế liposome ở nhiệt độ quá không kết hợp lực phân tán (M8-0) cho tiểu cao, vì khi đó, lớp màng phospholipid quá lỏng phân có kích thước rất lớn và không đồng lẻo, khó tạo liposome. nhất (Zaverage = 985,1 nm, PDI = 0,465). Công Hiệu suất liposome hóa cho thấy: khi thức M8-39, M8-69 và M8-99 đều cho nhiệt độ gần kề với nhiệt độ chuyển dạng liposome có kích thước tương đối nhỏ và của phospholipid, liposome không những độ đồng nhất cao. Trong đó, công thức đạt kết quả tốt về KTTP, độ đồng nhất mà M8-39 tạo liposome có KTTP nhỏ nhất và còn đạt hiệu suất cao hơn các nhiệt độ khác. độ đồng nhất cao nhất. Đồng thời, hiệu suất liposome hóa của công thức M8-39 cũng Từ kết quả trên, lựa chọn nhiệt độ phối cao hơn khi so sánh với công thức M8-69 hợp 2 pha là 60oC trong bào chế liposome để và M8-99. Do đó, lựa chọn tốc độ khuấy tiếp tục nghiên cứu. trộn 2 pha là 3.900 vòng/phút để tiến hành 3. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tốc bào chế liposome AmB. khuấy trộn tới đặc tính của liposome. 4. Kết quả đánh giá đặc tính của mẫu Bào chế các mẫu liposome theo quy trình liposome AmB đã lựa chọn. và điều kiện lựa chọn. Cố định tỷ lệ thể tích Tiến hành bào chế 3 mẫu liposome AmB ethanol/nước là 8/100 và nhiệt độ phối hợp theo công thức và quy trình bào chế như ở 2 pha là 600C để khảo sát ảnh hưởng của phần phương pháp nghiên cứu với các tốc độ khuấy trộn khi phối hợp tới đặc tính thông số lựa chọn: tỷ lệ thể tích pha của liposome. Mẫu được bào chế với tốc độ ethanol/pha nước là 8/100, nhiệt độ phối khuấy trộn là 0, 3.900, 6.900 và 9.900 hợp 2 pha là 600C và tốc độ khuấy trộn vòng/phút. 3.900 vòng/phút Bảng 3: Đặc tính các mẫu liposome Bảng 4: Đặc tính các mẫu liposome được bào chế với tốc độ khuấy trộn khác AmB. nhau. Hµm HiÖu suÊt TèC ®é HiÖu suÊt Zaverage MÉu PDI l•îng lIposome Zaverage (d.nm) MÉu khuÊy trén PDI liposome (d.nm) AmB (mg) hãa (%) (v/ph) hãa (%) M8-1 204,3 0,120 32,19 73,53 Không Không M8-0 693,1 0,509 khuấy trộn đánh giá M8-2 177,8 0,128 33,67 73,98 M8-39 3.900 204,3 0,120 73,53 M8-3 189,1 0,159 32,53 72,10 190,4 ± 0,136 ± 32,80 ± 73,20 ± M8-69 6.900 220,2 0,242 73,11 X + SD 13,3 0,02 0,78 0,98 M8-99 9.900 289,3 0,312 69,10 11
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 hợp 600C, tốc độ khuấy trộn 3.900 vòng/phút cho quy trình bào chế liposome AmB bằng phương pháp tiêm ethanol. Quy trình bào chế được tiến hành với thời gian ngắn, dễ thực hiện, cho kết quả liposome AmB có KTTP tương đối nhỏ, phân bố đồng nhất và hiệu suất liposome hóa khá cao (> 70%). Đây là những kết quả ban đầu làm tiền đề để tiến hành nghiên cứu tiếp theo nhằm bào chế liposome AmB theo phương pháp tiêm ethanol có hiệu suất liposome hoá cao hơn vµ ë quy m« s¶n xuÊt. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Võ Xuân Minh, Phạm Thị Minh Huệ. Kỹ thuật nano và liposome ứng dụng trong dược phẩm, mỹ phẩm. NXB Y học. 2013, tr.50-55. 2. Anastasia S Domazou, Pier Luigi Luisi. Size distribution of spontaneously formed liposomes by the alcohol injection method. Journal of Liposome Research. 2002, 12 (3), pp.205-220. 3. Deepak Singodia, Ashwni Verma et al. Investigations on feasibility of in situ development of Hình 2: Cấu trúc tiểu phân liposome AmB amphotericin B liposomes for industrial bằng phương pháp chụp TEM. applications. Journal of Liposome Research. Với quy trình bào chế và các thông số đã 2012, 22 (1), pp.8-17. lựa chọn, liposome AmB bào chế được có 4. Lasic, DD. Handbook of biological physics, KTTP tương đối nhỏ (khoảng 190,4 nm), độ chapter 10, applications of liposome. Elsevier đồng nhất cao (PDI khoảng 0,136), hiệu Science B.V. California. 1995. suất liposome hóa khoảng 73,20%. Hình 5. Miquel Pons, Merc Foradada; Joan Estelrich. ảnh chụp TEM cho thấy liposome AmB có Liposomes obtained by the ethanol injection hình cầu, kích thước khá nhỏ, cấu trúc đa method. International Journal of Pharmaceutics. khoang, đa lớp nhưng số khoang số lớp 1993, 95, pp.51-56. không nhiều (< 3 khoang/lớp trong 6. Oselys Rodriguez Justo, Angela Maria 1 liposome). Moraes. Analysis of process parameters on the characteristics of liposomes prepared by ethanol KẾT LUẬN injection with a view to process scale-up: Effect Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát ảnh of temperature and batch volume. Chemical hưởng và lựa chọn tỷ lệ thể tích pha Engineering Research and Design. 2011, 89, ethanol/pha nước là 8/100, nhiệt độ phối pp.785-792. 12