Bước đầu đánh giá biến đổi của gen MT - ATP6 ty thể trên bệnh nhân ung thư vú ở Việt Nam

Nội dung text: Bước đầu đánh giá biến đổi của gen MT - ATP6 ty thể trên bệnh nhân ung thư vú ở Việt Nam

1. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 75-84 Bước đầu đánh giá biến đổi của gen MT-ATP6 ty thể trên bệnh nhân ung thư vú ở Việt Nam Nguyễn Thị Tú Linh, Nguyễn Thị Thảo, Đỗ Thị Dung, Trịnh Hồng Thái* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 03 tháng 10 năm 2017 Chỉnh sửa ngày 04 tháng 11 năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 07 tháng 12 năm 2017 Tóm tắt: Gen MT-ATP6 ty thể mã hóa cho tiểu đơn vị protein a, trung tâm của kênh proton của phức hệ tổng hợp ATP. Biến đổi của gen MT-ATP6 được cho là ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp ATP và có liên quan với quá trình tạo u. Trong nghiên cứu này, biến đổi của gen MT-ATP6 được xác định trên 102 mẫu mô của bệnh nhân ung thư vú và 65 mẫu máu đối chứng sử dụng phương pháp PCR giải trình tự trực tiếp và PCR-RFLP, sau đó sử dụng các phương pháp phân tích thống kê để đánh giá mối liên quan giữa một số biến đổi điển hình với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú. Kết quả đã xác định được 20 biến đổi của gen MT-ATP6 trên 35 mẫu mô u của bệnh nhân ung thư vú và 13 biến đổi trên 26 mẫu máu của người bình thường, trong đó có 12 biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin và 1 biến đổi 9183insC chưa được công bố trước đây. Đa số các biến đổi có tần suất thấp từ 2,86% đến 5,71%. Các biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin G9053A và G8584A với tần suất cao trên mẫu mô u được sàng lọc trong các mẫu nghiên cứu. Kết quả cho thấy tỉ lệ dạng biến đổi G9053A và G8584A tương ứng là 21,6% (22/102 trường hợp) và 24,5% (25/102 trường hợp) ở mô của bệnh nhân ung thư vú và 18,5% (12/65 trường hợp) ở mẫu máu của người bình thường. Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ biến đổi G9053A và G8485A khi so sánh giữa nhóm bệnh nhân và đối chứng cũng như theo các đặc điểm bệnh học của ung thư vú như độ tuổi, kích thước khối u, số hạch, kích thước hạch, mức độ xâm lấn (giai đoạn T), mức độ hạch (giai đoạn N), mức độ biệt hóa của khối u và giai đoạn bệnh. Nghiên cứu này cho thấy biến đổi của gen MT-ATP6 khác nhau tùy thuộc vào từng nhóm bệnh nhân. Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú Việt Nam, tỉ lệ biến đổi G9053A và G8485A tương đối cao, tuy nhiên các biến đổi này không có mối liên hệ có ý nghĩa thống kê với bệnh ung thư vú. Từ khóa: ADN ty thể, MT-ATP6, Ung thư vú. 1. Mở đầu hệ I - IV) và một phức hệ tổng hợp ATP (phức hệ V) nằm ở màng trong của ty thể [1]. Để đảm Ty thể là bào quan đóng vai trò quan trọng nhận chức năng này, ADN ty thể có 37 gen, mã trong quá trình tạo ra năng lượng của tế bào, hóa cho 2 rARN, 22 tARN cần thiết cho quá ATP, thông qua chuỗi vận chuyển điện tử được trình tổng hợp protein của ty thể và 13 protein tạo thành từ 4 phức hệ enzyme hô hấp (các phức của các phức hệ I, III, IV và V [2]. Phức hệ tổng hợp ATP (phức hệ V) là một enzyme sử dụng _______ một dòng các proton đi qua màng trong của ty Tác giả liên hệ. ĐT.: 84-4-38582798. thể để tổng hợp nên ATP từ ADP. Nó bao gồm Email: thaith@vnu.edu.vn một phần nằm ở trên màng của ty thể (F0) chứa 7 5
2. 76 N.T.T. Linh và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 75-84 một kênh proton và một thành phần xúc tác (F1) gọi là mô u) và mô liền kề (cách mép u khoảng liên kết với F0 nằm ở trong chất nền của ty thể 5 cm) của 102 bệnh nhân ung thư vú được phẫu [3]. F0 có 9 tiểu đơn vị protein, trong đó có 2 tiểu thuật triệt căn có vét hạch và chẩn đoán xác đơn vị a và A6L được mã hóa tương ứng bởi các định bằng mô bệnh học tại Khoa Giải phẫu gen MT-ATP6 và MT-ATP8 của ty thể [4]. Trong bệnh - Tế bào, Bệnh viện K trong thời gian từ 2 gen này, sản phẩm của gen MT-ATP6 được coi tháng 12/2012 đến tháng 12/2013. Các bệnh là trung tâm của kênh proton của phức hệ tổng nhân đã được chẩn đoán xác định là ung thư hợp ATP [2] bởi vì F0 không thể hoạt động được biểu mô ống tuyến vú và có kết quả chẩn đoán nếu thiếu tiểu đơn vị a [5]. xác định bằng mô bệnh học sau mổ là ung thư Gen MT-ATP6 (hay còn được gọi với tên vú. Các mẫu bệnh phẩm được lấy vào vùng khác là ATP6 hay ATPase6) có kích thước 681 không bị hoại tử và loại trừ các trường hợp ung bp, từ vị trí 8527 đến 9207 trên ADN ty thể. thư di căn từ nơi khác đến kèm với danh sách Đột biến của gen MT-ATP6 được báo cáo sớm một số đặc điểm bệnh học bao gồm độ tuổi, nhất trong các khiếm khuyết của phức hệ V [6] kích thước khối u, số hạch, kích thước hạch, và là các biến đổi được nghiên cứu nhiều nhất giai đoạn TNM và mức độ biệt hóa của khối u. trong phức hệ V cho đến nay [3]. Các biến đổi Mẫu đối chứng bao gồm mẫu máu của 65 người của gen MT-ATP6 cũng đã được báo cáo trong cho máu bình thường do Khoa Sàng lọc máu, nhiều dạng ung thư khác nhau, bao gồm ung Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương thư vú, đại trực tràng, ung thư buồng trứng và cung cấp. Nghiên cứu được thực hiện đúng theo một số dạng ung thư khác [7-9]. Tuy nhiên, vai các quy định hiện hành về đạo đức trong nghiên trò của các biến đổi này trong bệnh ung thư vẫn cứu y học trong việc thu thập các mẫu máu và còn nhiều điều chưa được làm sáng tỏ. mô của bệnh nhân. Các dẫn liệu thu được đều Cho đến nay, vai trò của các đột biến ADN được giữ bí mật, chỉ nhằm phục vụ cho mục ty thể trong quá trình phát sinh và tiến triển ung đích nghiên cứu, không sử dụng cho mục đích thư đã được chứng minh rõ ràng và kết quả cho nào khác. thấy chúng có tiềm năng sử dụng làm chỉ thị phân tử trong một số bệnh ung thư [8]. Đặc biệt 2.2. Phương pháp đối với ung thư vú, loại ung thư phổ biến nhất Tách chiết ADN tổng số và PCR giải trình và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong tự trực tiếp: ADN tổng số được tách chiết từ các loại ung thư ở nữ giới (Globocan, 2012), mẫu mô và mẫu máu sử dụng QIAamp DNA việc tìm kiếm các chỉ thị phân tử nhằm đánh giá Mini Kit và QIAamp DNA Blood Mini Kit tiến triển, di căn xa, sàng lọc và phát hiện sớm (QIAGEN, Đức) tương ứng theo quy trình của bệnh sẽ giúp cho việc điều trị được hiệu quả nhà sản xuất. Nồng độ ADN tổng số được xác hơn. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm định bằng máy quang phổ NanoDrop 2000c đánh giá biến đổi của gen MT-ATP6 ty thể trong (Thermoscientific, Mỹ). Các cặp mồi đặc hiệu mẫu mô của bệnh nhân ung thư vú và tìm hiểu cho từng đoạn ADN quan tâm được thiết kế sử mối liên quan giữa các biến đổi này với các đặc dụng chương trình Primer-BLAST với trình tự điểm bệnh học của ung thư vú trên một nhóm đối ADN ty thể được tham khảo từ cơ sở dữ liệu tượng bệnh nhân người Việt Nam. trong NCBI (mã số NC-012920.1). Trong đó, cặp mồi ATP6 được sử dụng để nhân đoạn ADN có kích thước 1148 bp sử dụng cho giải 2. Nguyên liệu và phương pháp trình tự trực tiếp được trình bày trong Bảng 1. Thành phần của phản ứng PCR bao gồm: 6,25 2.1. Nguyên liệu µl Maxima Hot Start PCR Master Mix 2X; 0,25 µl mỗi mồi (0,2 µM); khuôn ADN (1 - 2,5 Mẫu nghiên cứu bao gồm mẫu mô ung thư ng/µl) và H O trong tổng thể tích 12,5 µl. Chu biểu mô ống tuyến vú (được lấy tại vị trí khối u, 2 trình nhiệt sử dụng với cặp mồi ATP6 để nhân
3. N.T.T. Linh và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 75-84 77 đoạn gen quan tâm như sau: 95°C: 4 phút, 35 0,25 µl mỗi mồi (0,2 µM); khuôn ADN (1 - 2,5 chu kỳ (95°C: 30 giây; 56°C: 30 giây; 72°C: 75 ng/µl) và H2O trong tổng thể tích 12,5 µl. Chu giây); 72°C: 5 phút, sau đó giữ ở 4°C. Sản trình nhiệt sử dụng với cặp mồi 9053 và 8584 phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel được thiết lập như sau: 95°C: 4 phút, 35 chu kỳ agarose 1,5%, tinh sạch bằng ExoSAP-IT (95°C: 30 giây; 54°C: 30 giây; 72°C: 30 giây); (Affymetrix, Mỹ) và giải trình tự (Công ty 1st 72°C: 5 phút, sau đó giữ ở 4°C. Sản phẩm PCR Base, Malaysia). có kích thước 298 bp và 292 bp được xử lý với Sàng lọc các biến đổi sử dụng phương pháp enzyme giới hạn Hin6I và SatI (Thermo PCR-RFLP: Các biến đổi được lựa chọn của Scientific, Mỹ) tương ứng theo hướng dẫn của gen MT-ATP6 (G9053A và G8584A) được tiến nhà sản xuất. Sản phẩm cắt enzyme giới hạn hành nhân bản sử dụng cặp mồi 9053 và 8584 (Bảng 1) được điện di kiểm tra trên gel agarose (Bảng 1) với thành phần phản ứng bao gồm: 2,5%. 6,25 µl Maxima Hot Start PCR Master Mix 2X; Bảng 1. Trình tự các cặp mồi và các enzyme giới hạn sử dụng trong xác định biến đổi của gen MT-ATP6 Kích thước Sản phẩm cắt Mục Tên Trình tự mồi Trình tự mồi Enzyme sử sản phẩm đích mồi xuôi (5’ – 3’) ngược (5’ – 3’) dụng Không Có biến (vị trí) biến đổi đổi Giải 1148 bp cagtttcatgccc gcctagtatgaggagc ATP6 - - - trình tự (8197-9344) atcgt gtta Sàng lọc 298 bp tacaccaaccacc gataagtgtagaggg Hin6I 252 bp, biến đổi 9053 298 bp (8802-9099) caactatct aaggttaaag 5’ G↓CGC 3’ 46 bp G9053A Sàng lọc 292 bp taaacacaaacta tagtataagagatcag SatI 160 bp, biến đổi 8584 292 bp (8451-8742) ccacctacctc gttcgtcgt 5’ GC↓NGC 3’ 132 bp G8584A oi Phân tích thống kê: Sử dụng phần mềm Trong nghiên cứu này, đoạn ADN có kích BioEdit để phân tích kết quả giải trình tự và thước 1148 bp chứa gen MT-ATP6 được nhân chương trình BLAST để so sánh trình tự thu bản và sử dụng để giải trình tự trực tiếp trên được với trình tự ADN chuẩn của ty thể một số mẫu nhằm xác định các dạng biến đổi (NC-012920.1). Mối liên quan giữa các dạng (Hình 1). Kết quả giải trình tự (minh họa ở biến đổi ở mẫu mô u và mô liền kề với một số Hình 2) đã phát hiện thấy 20 biến đổi của gen đặc điểm bệnh học của ung thư vú được phân MT-ATP6 trên 35 mẫu mô u của bệnh nhân ung tích bằng kiểm định 2 hoặc kiểm định Fisher thư vú và 13 biến đổi trên 26 mẫu máu của sử dụng phần mềm SPSS23. Đối với mỗi biến người bình thường. Trong số đó, có 5 biến đổi đổi, tỉ số nguy cơ OR và khoảng tin cậy 95% G8584A, A8701G, A8860G, G9053A và được tính toán để xác định mối liên quan với G9055A được thấy xuất hiện ở cả mẫu mô và nguy cơ mắc ung thư vú. Tất cả các kiểm định mẫu máu đối chứng (Bảng 2). Tất cả các biến thống kê được ghi nhận theo 2 chiều và giá trị p đổi đã được báo cáo trên cơ sở dữ liệu của < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Mitomap, trừ biến đổi 9183InsC chưa được công bố trước đây. Đặc biệt, các biến đổi này đều ở trạng thái đồng tế bào chất 3. Kết quả và thảo luận (homoplasmy). 3.1. Giải trình tự gen MT-ATP6 ty thể và phân tích các dạng biến đổi
4. 78 N.T.T. Linh và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 75-84 j Hình 1. Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% M: Thang chuẩn ADN 1 kb. Giếng 1-3: Sản phẩm PCR từ mẫu mô (#33157, 33538, 33695). Giếng 4- 6: Sản phẩm PCR từ mẫu máu (#29049, 28988, 29110). Giếng 7: Hình 2. Một số biến đổi của gen MT-ATP6 được xác Đối chứng âm (H20). định bằng giải trình tự Bảng 2. Thống kê biến đổi của gen MT-ATP6 trên mẫu mô u của bệnh nhân ung thư vú và mẫu máu bình thường Tần suất Thay đổi axít TT Vị trí Biến đổi Công bố amin Mẫu mô Mẫu máu 1 8575 C > T L – L 1/35 - + 2 8584 G > A A – T 11/35 1/26 + 3 8603 T > C F – S 1/35 - + 4 8610 T > C P – P 1/35 - + 5 8697 G > A M – M 1/35 - Ung thư tuyến giáp 6 8701 A > G T – A 13/35 11/26 Ung thư tuyến giáp 7 8718 A > G K – K - 1/26 + 8 8772 T > C T – T 1/35 - + 9 8784 A > G G – G 1/35 - + 10 8829 C > T N – N 1/35 - + 11 8835 C > T A – A - 2/26 + 12 8853 A > G W – W - 1/26 + 13 8860 A > G T – A 35/35 26/26 + 14 8866 A > G I – V 1/35 - + 15 8868 T > C I – I 1/35 - + 16 8896 G > A A – T 2/35 - + 17 8922 C > T G – G - 1/26 + 18 8972 T > C L – P 1/35 - + 19 9000 A > G V – V 1/35 - + 20 9053 G > A S – N 8/35 2/26 + 21 9055 G > A A – T 1/35 1/26 + 22 9076 A > T I – F 1/35 - + 23 9090 T > C S – S 1/35 - + 24 9123 G > A L – L - 1/26 + 25 9127 A > G I – V - 1/26 + 26 9165 T > C V – V - 1/26 + 27 9183 InsC - 1/26 k 28 9202 A > C T – P 1/35 - + Chú thích: (+): Đã công bố trên MITOMAP. (k): Chưa công bố trên Mitomap
5. N.T.T. Linh và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 75-84 79 Trong số 20 biến đổi của gen MT-ATP6 trực tiếp cho thấy 100% các mẫu đều có biến được xác định trên mẫu mô u của bệnh nhân, có đổi A8860G. Biến đổi từ A > G tại vị trí 8860 9 biến đổi không làm thay đổi trình tự axít amin tạo ra 1 điểm cắt của enzyme Hin6I làm cho các và 11 biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin mẫu không có biến đổi G9053A được cắt tại 2 (Bảng 2). Trong đó, 2 biến đổi G8697A (1/35 vị trí và tạo ra 3 băng có kích thước là 195 bp, mẫu) và A8701G (13/35 mẫu) đã được công bố 57 bp và 46 bp. Tương tự, với các mẫu có đồng trong ung thư tuyến giáp. Ngoài một số biến đổi thời 2 biến đổi G9053A và A8860G thì enzyme làm thay đổi trình tự axít amin có tần suất cao Hin6I sẽ cắt tại 1 vị trí và tạo thành 2 băng có là A8701G (37,14%, 13/35 mẫu), G8584A kích thước 241 bp và 57 bp. Kết quả này cho (31,43%, 11/35 mẫu) và G9053A (22,86%, thấy ở giếng số 2 là mẫu có biến đổi G9053A 8/35 mẫu), các biến đổi còn lại được xác định và giếng số 4 là mẫu không có biến đổi. Tiến với tần suất từ 2,86% - 5,71% (1 - 2 mẫu). hành sàng lọc trên các mẫu nghiên cứu cho thấy tỉ Riêng biến đổi A8860G được xác định thấy có lệ dạng biến đổi 9053A là 21,6% (22/102 trường mặt trong 100% mẫu giải trình tự. Trên mẫu hợp) ở mô của bệnh nhân ung thư vú và 18,5% máu đối chứng, kết quả đã xác định được tổng (12/65 trường hợp) ở mẫu máu của người bình số 13 biến đổi, trong đó có 6 biến đổi làm thay thường. Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý đổi trình tự axít amin (Bảng 2). Những biến đổi nghĩa thống kê với p = 0,627 (Bảng 3). có tần suất cao gặp trong mẫu máu của người Tương tự, biến đổi G8584A được sàng lọc bình thường là G8860A (100%, 26/26 mẫu) và trên các mẫu nghiên cứu sử dụng enzyme SatI A8701G (42,31%, 11/26 mẫu). Kết quả này cho (Thermo Scientific, Mỹ). Theo Hình 4, các mẫu thấy biến đổi của gen MT-ATP6 trên mẫu máu không biến đổi sẽ cho 2 băng có kích thước 160 đối chứng có tần suất thấp hơn so với biến đổi bp và 132 bp (giếng 5). Ngược lại, các mẫu có được tìm thấy trong mẫu mô của bệnh nhân. Từ biến đổi sẽ cho duy nhất 1 băng ADN có kích kết quả nghiên này, chúng tôi đã tiến hành lựa thước là 292 bp (giếng 2, 3). Kết quả sàng lọc chọn 2 biến đổi G9053A và G8584A là các biến trên các mẫu nghiên cứu cho thấy không có sự đổi làm thay đổi trình tự axít amin của phân tử khác biệt có ý nghĩa thống kê (p = 0,359) về tỉ protein, có tần suất cao trên mẫu mô u và tần suất lệ biến đổi G8584A trên các mẫu của bệnh nhân thấp trên mẫu máu của người bình thường để thực ung thư vú và đối chứng, trong đó, tỉ lệ dạng hiện phản ứng PCR-RFLP nhằm sàng lọc trên các biến đổi 8584A được xác định là 24,5% (25/102 mẫu nghiên cứu. trường hợp) ở mô u và lân cận u của bệnh nhân và 18,5% (12/65 trường hợp) ở mẫu máu của 3.2. Tần suất biến đổi G9053A và G8584A bình thường (Bảng 3). trong các mẫu nghiên cứu 3.3. Mối liên quan giữa biến đổi G9053A và Biến đổi G9053A được sàng lọc trên các G8584A với một số đặc điểm bệnh học của ung mẫu nghiên cứu bằng phương pháp PCR-RFLP thư vú sử dụng enzyme Hin6I (Thermo Scientific, Mỹ). Theo tính toán, nếu không có biến đổi Nghiên cứu mối liên quan giữa biến đổi (9053G) thì enzyme sẽ cắt sản phẩm PCR có G9053A và G8584A với một số đặc điểm bệnh kích thước 298 bp thành 2 đoạn ADN có kích học của ung thư vú đã cho thấy không có mối thước 252 bp và 46 bp. Ngược lại, nếu có biến liên quan giữa tỉ lệ biến đổi G9053A và đổi (9053A) thì enzyme sẽ không cắt và tạo G8485A ở mô u với các đặc điểm bệnh học của thành 1 băng duy nhất có kích thước bằng sản ung thư vú như độ tuổi, kích thước khối u, số phẩm PCR (298 bp). Tuy nhiên, kết quả cắt hạch, kích thước hạch, mức độ xâm lấn (giai enzyme ở Hình 3 cho thấy: tại giếng 2 xuất hiện đoạn T), mức độ hạch (giai đoạn N), mức độ 2 băng có kích thước 241 bp và 57 bp, giếng 4 biệt hóa của khối u và giai đoạn bệnh (Bảng 3). xuất hiện 3 băng. Kết quả này khác so với tính toán ban đầu. Kiểm tra lại bằng giải trình tự j
6. 80 N.T.T. Linh và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 75-84 Hình 3. Ảnh điện di xác định biến Hình 4. Ảnh điện di xác định biến đổi đổi G9053A bằng enzyme Hin6I trên G8584A bằng enzyme SatI trên gel gel agarose 2,5%. agarose 2,5%. M: Thang chuẩn ADN 50 bp. Giếng M: Thang chuẩn ADN 50 bp. Giếng 1, 1, 3: sản phẩm PCR mẫu mô u của 4: sản phẩm PCR mẫu mô u của bệnh bệnh nhân (#48839 và #50264). nhân (#34891 và #31403). Giếng 2, 3: Giếng 2: Sản phẩm cắt mẫu mô u có Sản phẩm cắt mẫu mô u và mô liền kề biến đổi G9053A (#48839). Giếng 4: có biến đổi G8584A (#34891). Giếng Sản phẩm cắt mẫu mô u không có 5: Sản phẩm cắt mẫu không có biến biến đổi G9053A (#50264). đổi G8584A (#31403). Bảng 3. Mối liên quan giữa biến đổi G9053A và G8584A của gen MT-ATP6 với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú 9053 8584 Đặc điểm n P1 P2 G (%, n) A (%, n) G (%, n) A (%, n) Loại mẫu Mô ung thư vú 102 78,4% (80) 21,6% (22) 75,5% (77) 24,5% (25) 0,627 0,359 Máu bình thường 65 81,5% (53) 18,5% (12) 81,5% (53) 18,5% (12) Độ tuổi < 50 38 76,3% (29) 23,7% (9) 81,6% (31) 18,4% (7) 0,606 0,306 ≥ 50 62 80,6% (50) 19,4% (12) 72,6% (45) 27,4% (17) Kích thước khối u (cm3) < 5 47 74,5% (35) 25,5% (12) 78,7% (37) 21,3% (10) 0,368 0,483 ≥ 5 55 81,8% (45) 18,2% (10) 72,7% (40) 27,3% (15) Số hạch < 10 75 80,0% (60) 20,0% (15) 76,0% (57) 24,0% (18) 0,521 0,842 ≥ 10 27 74,1% (20) 25,9% (7) 74,1% (20) 25,9% (7) Kích thước hạch (cm) ≤ 0,5 43 81,4% (35) 18,6% (8) 76,7% (33) 23,3% (10) 0,505 0,764 > 0,5 58 75,9% (44) 24,1% (14) 74,1% (43) 25,9% (15) Mức độ xâm lấn (giai đoạn T) T 82 75,6% (62) 24,4% (20) 75,6% (62) 24,4% (20) 1-2 0,232* 1,0* T3-4 19 89,5% (17) 10,5% (2) 73,7% (14) 26,3% (5) Mức độ hạch (giai đoạn N) N 56 76,8% (43) 23,2% (13) 76,8% (43) 23,2% (13) 0 0,697 0,689 N1-2 45 80,0% (36) 20,0% (9) 73,3% (33) 26,7% (12) Mức độ biệt hóa Rõ 10 80,0% (8) 20,0% (2) 90,0% (9) 10,0% (1) Vừa 66 77,3% (51) 22,7% (15) 0,980 69,7% (46) 30,3% (20) 0,136 Kém 23 78,3% (18) 21,7% (5) 87,0% (20) 13,0% (3) Giai đoạn bệnh Giai đoạn 0 - II 80 80,0% (64) 20,0% (16) 72,5% (58) 27,5% (22) 0,397* 0,212 Giai đoạn III - IV 21 71,4% (15) 28,6% (6) 85,7% (18) 14,3% (3) Chú thích: n: số lượng mẫu. P: các giá trị p nhận được từ kiểm định Fisher (*) và kiểm định χ2 khi 1 2 so sánh các mẫu có biến đổi G9053A ( ) và biến đổi G8584A ( ). Giai đoạn 0 - I: T0-2N0M0; Giai đoạn II: T3-4N0M0; Giai đoạn III: T1-4N1M0, Tbất kỳN2M0; Giai đoạn IV: Tbất kỳNbất kỳM1 4. Thảo luận lượng ATP và tổng hợp mới các nucleotide, lipid và protein cần cho tăng sinh nhanh chóng Biến đổi của các gen ty thể từ lâu đã được [12]. Ở tế bào bình thường, ATP chủ yếu được cho là có liên quan với quá trình tạo u bởi vì tổng hợp ở ty thể thông qua chu trình axít các tế bào ung thư cần sử dụng nhiều năng tricarboxylic (TCA) và sau đó là OXPHOS.
7. N.T.T. Linh và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 75-84 81 Ngược lại, theo Warburg, các tế bào ung thư xuất hiện 2 lần và 2 biến đổi (8,7%) xuất hiện 3 dựa chủ yếu vào đường phân để sản xuất ATP lần [16]. Một nghiên cứu trên 30 bệnh nhân ung ngay cả khi có mặt oxi. Điều này cho thấy chức thư vú người Mizoram, Ấn Độ và nhóm đối năng phosphoryl hóa oxi hóa của ty thể có thể chứng đã tìm thấy 9 đột biến thay thế bị biến đổi trong các tế bào ung thư [12]. Phức nucleotide trên 2 gen MT-ATP6 và MT-ATP8 hệ V của ty thể đóng vai trò quan trọng trong trong 5 mẫu nghiên cứu (chiếm 62,5%). Trong quá trình tạo ATP và con đường chết theo đó các biến đổi G8584A, T8602C và G8701A chương trình của tế bào và do đó nếu gen dẫn đến sự thay đổi axít amin A20T, F26L và MT-ATP6 của phức hệ V bị biến đổi thì sẽ liên T59A tương ứng, từ đó có thể dẫn đến sai hỏng quan đến sự chuyển đổi của tế bào [8]. Theo trong hệ thống OXPHOS của ty thể. Kết quả tổng kết của Lu và cs (2009), có 55 đột biến của cũng cho thấy tỉ lệ đột biến nucleotide của gen gen MT-ATP6 đã được báo cáo trong nhiều MT-ATP6 và MT-ATP8 cao hơn so với gen dạng ung thư khác nhau như ung thư vú, đại ND1 (chiếm 25%) trong cùng nghiên cứu và trực tràng, ung thư phổi và một số dạng ung thư gen MT-ATP6 bị biến đổi nhiều hơn so với gen khác, tuy nhiên, vai trò của các biến đổi này MT-ATP8 trên nhóm bệnh nhân ung thư vú trong quá trình phát sinh ung thư vẫn còn nhiều Mizoram, tương tự như trong các quần thể điều chưa được làm sáng tỏ [9]. khác. Nhóm tác giả cũng cho rằng các gen MT- Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, các ATP6/8 dễ biến đổi hơn trong bệnh ung thư vú biến đổi của gen MT-ATP6 đã được báo cáo và có thể giữ một vai trò quan trọng trong quá trong một số nghiên cứu trước đây, tuy nhiên trình sinh ung thư bằng cách thay đổi mức độ kết quả thu được rất khác biệt trên các nhóm trao đổi năng lượng trong tế bào ung thư [17]. bệnh nhân khác nhau. Sharp và cs (1992) Trong nghiên cứu này, kết quả xác định được nghiên cứu trên 17 bệnh nhân và không phát 20 biến đổi của gen MT-ATP6 trên 35 mẫu mô hiện thấy có biến đổi nào trên gen MT-ATP6 u và 13 biến đổi trên mẫu máu đối chứng, trong [13]. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu đó, có duy nhất 1 biến đổi 9183InsC chưa thấy của Chintha và cs (2013) trên 180 bệnh nhân được công bố trước đây. Các biến đổi đều ở ung thư vú [14]. Ngược lại, nghiên cứu của Tan dạng đồng tế bào chất, trong đó, đa số xuất hiện và cs (2002) trên các mẫu mô u và mô liền kề với tần suất thấp (81,8%, 27/33 biến đổi) và của bệnh nhân ung thư vú đã phát hiện thấy 1 làm thay đổi trình tự axít amin của chuỗi đột biến soma (T9131C) và 8 đột biến dòng protein (51,52%, 17/33 biến đổi). Mặc dù vậy, mầm của gen MT-ATP6, trong đó có 4 đột biến vai trò của các biến đổi có tác động đến cấu trúc mới chưa được công bố trước đó [15]. và chức năng của phân tử protein có mối liên Grzybowska-Szatkowska và cs (2014) cũng quan với quá trình tạo u hay không cần phải phát hiện thấy 8 biến đổi nucleotide của gen được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn bởi vì các MT-ATP6, chiếm 72% (36/50) bệnh nhân được nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng một số đột nghiên cứu, trong đó có 5 biến đổi G8557A, biến soma của gen MT-ATP6 ở mô ung thư G8697A, T8793C, G8854A và A8860G đã đóng vai trò là tác nhân gây bệnh và tham gia được công bố trong Cơ sở dữ liệu hệ gen ty thể vào quá trình tạo u. Ví dụ, Petros và cs (2005) người của Đại học Uppsala và 3 biến đổi mới đã xác định thấy biến đổi T8993G có vai trò lần đầu tiên được công bố (G8858C, T9119G, làm tăng tốc độ phát triển của khối u đối với C9130G) [4]. Gần đây, Ghaffarpour và cs ung thư tuyến tiền liệt bằng cách tăng sản sinh (2014) giải trình tự toàn bộ gen MT-ATP6 của ra các gốc tự do chứa oxy (ROS) và oxy hóa ít 49 bệnh nhân ung thư vú Iran và phát hiện được pyruvate và NADH hơn dẫn đến chuyển sang 23 biến đổi (chiếm 82,14%) ở mô u của bệnh con đường hô hấp hiếu khí [2]. Tương tự, nhân thuộc gen MT-ATP6. Trong đó, đa số các nghiên cứu của Shidara và cs (2005) cũng cho biến đổi có tần suất thấp: 16 biến đổi (69,6%) thấy đột biến T8993G và T9176C thúc đẩy quá chỉ xuất hiện duy nhất 1 lần, 4 biến đổi (17,4%) trình tạo u bằng cách ngăn chặn quá trình
8. 82 N.T.T. Linh và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 75-84 apoptosis mặc dù cơ chế chi tiết vẫn chưa được tuổi, kích thước khối u, số hạch, kích thước hiểu biết rõ [18]. hạch, mức độ xâm lấn (giai đoạn T), mức độ Ngoài các đột biến của ADN ty thể tác động hạch (giai đoạn N), mức độ biệt hóa của khối u trực tiếp đến phân tử protein, sự có mặt của các và giai đoạn bệnh. Trong nghiên cứu của đa hình ADN ty thể cũng được cho là đóng vai Ghaffarpour và cs (2014) trên 49 bệnh nhân ung trò quan trọng vì chúng gây ra một sự gia tăng thư vú Iran, các biến đổi của gen MT-ATP6 xác nhẹ, gần như không thể phát hiện được, trong định được không có mối liên hệ có ý nghĩa sản xuất ROS và có thể tạo ra ưu thế chọn lọc thống kê với các đặc điểm bệnh học của bệnh đối với các ADN đột biến [4]. Ví dụ, biến đổi ung thư vú như độ tuổi, độ mô học, giai đoạn A8860G của gen MT-ATP6 đã được báo cáo là TNM, kích thước khối u, tình trạng hạch đa hình trong các nghiên cứu trước đây với tần lympho, tình trạng di căn hạch Các biến đổi suất từ 79 - 100% trong ung thư vú [15, 16, 19] G9053A và G8584A không xác định thấy trong và từ 75 - 100% trong các dạng ung thư khác nhóm bệnh nhân này [16]. Tương tự, [1]. Mặc dù biến đổi này làm thay đổi axít amin Grzybowska-Szatkowska và cs (2014) xác định từ threonine thành alanine ở vùng protein kém thấy 8 biến đổi ở 36/50 bệnh nhân ung thư vú, bảo thủ và không tác động đến cấu trúc của tuy nhiên, không có bệnh nhân nào có biến đổi protein, tuy nhiên nó vẫn có thể ảnh hưởng đến G9053A và G8584A [4]. Trong nghiên cứu của các đột biến của ADN nhân và ADN ty thể khác Thapa và cs (2016) trên 8 bệnh nhân ung thư vú và có thể làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú Ấn Độ và 5 đối chứng, biến đổi G8485A được [16]. Tương tự, biến đổi đa hình G9055A, làm xác định với tần suất 12,5% (1/8 bệnh nhân) và thay đổi axít amin alanine thành threonine ở không có trường hợp nào có biến đổi G9053A vùng protein bảo thủ và có thể ảnh hưởng đến [17]. Như vậy, có thể thấy tỉ lệ của biến đổi cấu trúc của phân tử protein, đã được báo cáo G9053A và G8485A khác nhau tùy thuộc vào với tần suất từ 10,5 - 18,6% và có thể làm tăng từng nhóm bệnh nhân. Trên đối tượng bệnh nguy cơ mắc cũng như tiến triển của ung thư vú nhân ung thư vú Việt Nam, tỉ lệ biến đổi tương [23]. Theo Czarnecka và cs (2010), một số đa đối cao, tuy nhiên, tần suất của các biến đổi này hình của gen MT-ATP6 cùng với các đột biến không có mối liên hệ có ý nghĩa thống kê với soma G8697A, A8706G, C9030T, A8701G (T- đặc điểm bệnh học của ung thư vú. A), A8716G (K-E), T9137C (I-T) ở tuyến giáp có liên quan với khối u tế bào Hürthle [8]. Giải thích cho điều này, Máximo và cs (2002) cho Lời cảm ơn rằng các đa hình của gen MT-ATP6 có thể dẫn đến sự sao chép ADN ty thể kém hiệu quả và Nghiên cứu này được tài trợ bởi Đại học dẫn đến các bất thường của ADN ty thể như Quốc gia Hà Nội trong đề tài mã số QG.16.14. mất đoạn lớn của ADN ty thể và sự hình thành của khối u [24]. Trong nghiên cứu này, 2 biến đổi đa hình Tài liệu tham khảo G9053A (S-N) và G8584A (A-T) lần đầu tiên được sàng lọc trong 102 mẫu mô của bệnh nhân [1] Chatterjee A, Dasgupta S, Sidransky D, ung thư vú người Việt Nam và 65 mẫu đối Mitochondrial subversion in cancer, Cancer Prev chứng. Tuy nhiên, tần suất của các biến đổi Res (Phila) 2011, 4(5):638-54. G9053A và G8584A ở nhóm bệnh nhân (21,6% [2] Petros JA, Baumann AK, Ruiz-Pesini E, Amin và 24,5% tương ứng) và nhóm đối chứng MB, Sun CQ, Hall J, Lim S, Issa MM, Flanders (18,5%) khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p WD, Hosseini SH, Marshall FF, Wallace DC, > 0,05). Bên cạnh đó, kết quả cũng cho thấy mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer, Proc Natl Acad Sci U S A 2005, không có mối liên quan giữa 2 biến đổi này với 102(3):719-24. các đặc điểm bệnh học của ung thư vú như độ
9. N.T.T. Linh và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 75-84 83 [3] Jonckheere AI, Smeitink JA, Rodenburg RJ, [15] Tan DJ, Bai RK, Wong LJ, Comprehensive Mitochondrial ATP synthase: architecture, scanning of somatic mitochondrial DNA function and pathology, J Inherit Metab Dis 2012, mutations in breast cancer, Cancer Res 2002, 35(2):211-25. 62(4):972-6. [4] Grzybowska-Szatkowska L, Slaska B, [16] Ghaffarpour M, Mahdian R, Fereidooni F, Rzymowska J, Brzozowska A, Florianczyk B, Kamalidehghan B, Moazami N, Houshmand M, Novel mitochondrial mutations in the ATP6 and The mitochondrial ATPase6 gene is more ATP8 genes in patients with breast cancer, Mol susceptible to mutation than the ATPase8 gene in Med Rep 2014, 10(4): 1772-8. breast cancer patients, Cancer Cell Int 2014, [5] Hejzlarová K, Mráček T, Vrbacký M, Kaplanová 14(1):21. V, Karbanová V, Nůsková H, Pecina P, Houštěk [17] Thapa S, Lalrohlui F, Ghatak S, Zohmingthanga J, J, Nuclear genetic defects of mitochondrial ATP Lallawmzuali D, Pautu JL, Senthil Kumar N, synthase, Physiol Res 2014, 63 Suppl 1:S57-71. Mitochondrial complex I and V gene [6] Holt IJ, Harding AE, Petty RK, Morgan-Hughes polymorphisms associated with breast cancer in JA, A new mitochondrial disease associated with mizo-mongloid population, Breast Cancer 2016, mitochondrial DNA heteroplasmy, Am J Hum 23(4):607-16. Genet 1990, 46(3): 428-33. [18] Shidara Y, Yamagata K, Kanamori T, Nakano K, [7] Copeland WC, Wachsman JT, Johnson FM, Penta Kwong JQ, Manfredi G, Oda H, Ohta S, Positive JS, Mitochondrial DNA alterations in cancer, contribution of pathogenic mutations in the Cancer Invest 2002, 20(4):557-69. mitochondrial genome to the promotion of cancer [8] Czarnecka AM, Kukwa W, Krawczyk T, Scinska by prevention from apoptosis, Cancer Res 2005, A, Kukwa A, Cappello F, Mitochondrial DNA 65(5):1655-63. mutations in cancer--from bench to bedside, Front [19] Czarnecka AM, Klemba A, Krawczyk T, Zdrozny Biosci 2010, 15:437-60. M, Arnold RS, Bartnik E, Petros JA, [9] Lu JSL, Bai Y, Implications of mitochondrial Mitochondrial NADH-dehydrogenase DNA mutations and mitochondrial dysfunction in polymorphisms as sporadic breast cancer risk tumorigenesis, Cell Research 2009, 19:802-15. factor, Oncol Rep 2010, 23(2):531-35. [10] Kulawiec M, Salk JJ, Ericson NG, Wanagat J, [20] Aikhionbare FO, Khan M, Carey D, Okoli J, Go Bielas JH, Generation, function, and prognostic R, Is cumulative frequency of mitochondrial DNA utility of somatic mitochondrial DNA mutations variants a biomarker for colorectal tumor in cancer, Environ Mol Mutagen 2010, 51(5): progression? Mol Cancer 2004, 3:30. 427-39. [21] Aikhionbare FO, Mehrabi S, Kumaresan K, [11] Plak K, Czarnecka AM, Krawczyk T, Golik P, Zavareh M, Olatinwo M, Odunsi K, Partridge E, Bartnik E, Breast cancer as a mitochondrial Mitochondrial DNA sequence variants in disorder (Review), Oncol Rep 2008, 21(4): epithelial ovarian tumor subtypes and stages, J 845-51. Carcinog 2007, 6:1. [12] Dumas JF, Rousse D, Servais S, Mitochondria and [22] Mehrabi S, Akwe JA, Adams G Jr, Grizzle W, cancer, Cellular Bioenergetics in Health and Yao X, Aikhionbare FO, Analysis of mtDNA Diseases: New Perspectives in Mitochondrial sequence variants in colorectal adenomatous Biology, 2012, 115-47. polyps, Diagn Pathol 2010, 5:66. [13] Sharp MG, Adams SM, Walker RA, Brammar [23] Bai RK, Leal SM, Covarrubias D, Liu A, Wong LJ, WJ, Varley JM, Differential expression of the Mitochondrial genetic background modifies breast mitochondrial gene cytochrome oxidase II in cancer risk, Cancer Res 2007, 67(10):4687-94. benign and malignant breast tissue, J Pathol 1992, [24] Máximo V, Soares P, Lima J, Cameselle-Teijeiro 168(2): 163-8. J, Sobrinho-Simões M, Mitochondrial DNA [14] Chintha R, Kaipa PR, Sekhar N, Hasan Q, somatic mutations (point mutations and large Mitochondria and tumors: A new perspective, deletions) and mitochondrial DNA variants in Indian J Cancer 2013, 50(3). human thyroid pathology: a study with emphasis on Hürthle cell tumors, Am J Pathol 2002, 160(5):1857-65.
10. 84 N.T.T. Linh và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 75-84 Preliminary Study of MT-ATP6 Gene’s Alterations in Patients with Breast Cancer in Vietnam Nguyen Thi Tu Linh, Nguyen Thi Thao, Do Thi Dung, Trinh Hong Thai VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam Abstract: The MT-ATP6 gene encodes for a protein subunit which is central to the proton channel of the ATP synthase. Mutations of MT-ATP6 gene can affect the ATP synthesis and may play an important role in the process of tumorigenesis. The purpose of this study was to identify potential changes of MT-ATP6 gene in pair of tumor and adjacent tissues of 102 patients with breast cancer and in blood samples of 65 controls by using direct DNA sequencing and PCR-RFLP method. Then, statistical analysis was used to analyze the association between some typical changes and pathological features of breast cancer. As a result, 20 changes in the MT-ATP6 gene in 35 examined breast cancer tissues and 13 changes in 26 blood control samples were reported, of which 12 alterations altered the amino acid and a variant, 9183insC, had not been described in the literature so far. Most of the variants had low frequencies from 2.86% to 5.71%. Two variants, G9053A and G8584A, which changed the amino acid sequence and had high frequency, were screened in all samples. Our results indicated that the frequencies of G9053A and G8584A were 21,6% (22/102 cases) and 24,5% (25/102 cases) respectively in tissues of breast cancer patients and 18,5% (12/65 cases) in normal blood controls. However, there was no statistically significant difference in G9053A and G8485A rates between breast cancer patients and controls as well as between mtDNA alterations and the pathological features of breast cancer such as age, size of tumors, number of lymph nodes, size of lymph nodes, T stage, N stage, tumor differentiation and stages of disease. This study showed that the variations of MT-ATP6 gene differed from patient groups. In Vietnamese patients with breast cancer, the rates of G9053A and G8485A were relatively high but these changes were not statistically related to breast cancer. Keywords: Breast cancer, mitochondrial DNA, MT-ATP6. kkkkk