Biệt hoá tế bào gốc trung mô tuỷ xương thỏ thành dạng tạo cốt bào trong môi trường dexamethasone và ascorbic

Nội dung text: Biệt hoá tế bào gốc trung mô tuỷ xương thỏ thành dạng tạo cốt bào trong môi trường dexamethasone và ascorbic

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 BIỆT HOÁ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TUỶ XƢƠNG THỎ THÀNH DẠNG TẠO CỐT BÀO TRONG MÔI TRƢỜNG DEXAMETHASONE VÀ ASCORBIC Lê Thị Hồng Nhung*; Ngô Duy Thìn*; Nguyễn Khang Sơn* TÓM TẮT 15 mẫu tế bào đơn nhân tủy xương thỏ nuôi cấy tăng sinh 14 ngày. Sau khi định danh bằng kỹ thuật hoá mô miễn dịch với các marker CD44, CD90, CD34, CD14 xác định là tế bào gốc trung mô (TBGTM), được đưa vào môi trường cảm ứng tạo xương có dexamethasone 1 µM và ascorbic 50 µg/ml trong thời gian 3 tuần. Kết quả: tất cả các mẫu tế bào nhuộm hóa mô đều có hiện tượng tạo canxi trong chất nền (dương tính khi nhuộm alirazin red). Quan sát các mẫu dưới kính hiển vi điện tử quét thấy xuất hiện tinh thể khoáng. Mẫu tế bào nhuộm hóa mô miễn dịch dương tính với marker osteocalcin. Kết luận: đ biệt hoá thành công TBGTM tủy xương thỏ thành tế bào dạng tạo cốt bào trong môi trường có dexamethasone và ascorbic. * Từ khóa: Tế bào trung mô; Tạo cốt bào; Biệt hóa; Dexamethasone; Ascorbic. Diffrentiation of Bone Marrow Mensenchymal Stem Cell into Osteoblast in Dexamethasone and Ascorbic Culture Summary 15 samples rabbit bone marrow mononuclear after culture for 14 days. Those were isolated by flow cytometry and immunocytochemistry staining with marker CD44, CD90, CD14, CD34. These analyses indicated that culture cells were MSCs. To induce osteoblast differentiation of the MSCs, the cultures were maintained in osteogenic media supplement with 1 µM dexamethasone, 50 µg/mL ascorbic acid for up to three weeks. Results: All samples after differentiation demonstrated that therre were actual calcium deposits in matrix by alizarin red staining. Under SEM appearance white crystals of MSC differentiation into osteogenic line. The cells were immunocytochemistry stained positive for osteocalcin. Conclusions: The bone marrow MSC tendency differentiation into osteoblast in dexamethasone and ascorbic acid. * Keywords: Mesenchymal stem cell;; Osteoblast; Differentiation; Dexamethasone; Ascorbic. ĐẶT VẤN ĐỀ bào (osteoblast), chúng phải trải qua giai Tạo cốt bào là một trong 4 tế bào của đoạn biệt hóa để tạo thành tiền tạo cốt mô xương có vai trò tạo xương mới trong bào (pre-osteoblast). Ngày nay với công giai đoạn phát triển của cơ thể hoặc khi nghệ, giai đoạn này có thể thực hiện trong mô xương bị tổn thương. Trong cơ thể, điều kiện in vitro nhằm tạo ra dòng tế bào các tế bào gốc trước khi trở thành tạo cốt có khả năng ứng dụng trên lâm sàng để * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Lê Thị Hồng Nhung (nhunglehmu@gmail.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017 173
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 điều trị các bệnh lý xương khớp, đặc biệt KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN là các bệnh không thể điều trị bằng phương 1. Hình dạng tế bào sau biệt hóa. pháp thông thường [1]. Kỹ thuật và môi trường biệt hóa TBGTM tủy xương thành tạo cốt bào đ được nhiều tác giả nghiên cứu. Trong phạm vi bài này, chúng tôi xin giới thiệu kết quả biệt hóa TBGTM tủy xương thỏ trong môi trường có dexamethasone, 50 µg/ml ascorbic, đây là những chất kích thích cảm ứng tạo xương. Mục tiêu của nghiên cứu: Nuôi cấy, biệt hóa thành công TBGTM tủy xương thỏ thành tạo cốt bào trong môi trường có dexamethasone và ascorbic. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP Hình 1: TBGTM sau biệt hóa theo hướng NGHIÊN CỨU tạo cốt bào 14 ngày (x500). 1. Đối tƣợng nghiên cứu. Quan sát tất cả các mẫu chúng tôi nhận 15 mẫu tế bào trung mô tủy xương thỏ. thấy có sự biến đổi rõ rệt về hình dạng tế bào theo thời gian. Càng về sau, các tế 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. bào có xu hướng phình to đoạn giữa giống Các tế bào đơn nhân được phân lập từ hình hạt đậu. Đây có thể là hình ảnh đặc tủy xương thỏ sau khi nuôi cấy tăng sinh trưng của tế bào tạo xương. 14 ngày, định danh bằng kỹ thuật hóa mô 2. Kết quả định danh tế bào sau biệt miễn dịch để khẳng định chắc chắn chúng hóa. là TBGTM. * Định danh bằng kỹ thuật nhuộm Đưa vào môi trường biệt hóa cảm ứng alizarin red: tạo xương để biệt hóa thành tạo cốt bào, gồm: 89% DMEM, 10% FBS, 1% kháng sinh, 1 µM dexamethasone, 50 µg/ml ascorbic, 100 mM β - glycerolphosphatase. Thời gian biệt hóa 3 tuần, thay môi trường 3 ngày/lần. Định danh sau biệt hóa bằng kỹ thuật alizarin để đánh giá khả năng lắng đọng canxi chất nền của tế bào. Đánh giá sự hình thành tinh thể khoáng bằng kỹ thuật hiển vi điện tử quét. Xác định marker osteocalcin của tế bào sau biệt hóa bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Mỗi phương pháp lấy ngẫu nhiên 5 mẫu trong 15 mẫu Hình 2: Tế bào sau biệt hóa 21 ngày nhuộm đ biệt hóa. alizarin red (x200). 174
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Trên tất cả các mẫu tế bào khi nhuộm với alizarin red đều cho kết quả đặc hiệu: tế bào và chất nền bắt màu đỏ cam, đây là phức hợp của thuốc nhuộm với ion canxi hiện diện trong tế bào hay chất nền ngoại bào, chứng tỏ tế bào được biệt hóa đ chuyển sang dạng tế bào tạo xương với lắng tụ canxi trong tế bào và chất nền ngoại bào. * Định danh bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch: Hình 3: Các tế bào sau biệt hóa 15 ngày nhuộm hóa mô miễn dịch với marker osteocalcin (x200). Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch với marker osteocalcin cho thấy tất cả các mẫu đều dương tính với osteocalcin. Osteocalcin là protein được tổng hợp nhiều trong tế bào tạo xương và được xem là marker của tế bào tạo xương. * Định danh bằng quan sát hình thành tinh thể khoáng dưới kính hiển vi điện từ quét: Hình 4: Tế bào gốc sau biệt hóa 30 ngày dưới hiển vi điện tử quét. (Các tinh thể muối khoáng lắng đọng trên bề mặt và xung quanh tế bào) 175
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Sau 3 tuần biệt hóa, trên tất cả các của tạo cốt bào. Osteocalcin là marker mẫu tế bào nuôi cấy quan sát dưới kính xương, đặc biệt xuất hiện muộn tăng cao hiển vi điện tử quét, đều thấy xuất hiện sau biệt hóa 28 ngày [3]. tinh thể khoáng rõ rệt. Lắng đọng tinh thể Quiroz F.G (2008) nghiên cứu biệt hóa khoáng trong mô nền quanh tế bào đang hMSC thành tạo cốt bào trong môi trường biệt hoá có xu hướng tăng dần về số chuyên biệt tạo xương, đánh giá sự tạo lượng. Các tinh thể khoáng này có dạng xương bằng khoáng hóa trong chất nền hình kim, hoặc hình bông tuyết, tập hợp thành đám, lớn dần theo thời gian. Nghiên và marker biểu hiện ở tạo cốt bào tại các cứu của chúng tôi cũng thấy, hình ảnh thời điểm 14 và 20 ngày và so sánh với lắng đọng tinh thể khoáng không xuất nhóm chứng. Sau 2 ngày biệt hóa, hình hiện trên các mẫu chứng là tế bào trung thái tế bào đ thay đổi, sau 5 ngày biệt mô được nuôi cấy trong môi trường thông hóa, tế bào có hình đa diện, nhóm tế bào thường, không có yếu tố gây biệt hoá. ở nhóm chứng không có thay đổi kiểu Chúng tôi cho rằng đây là minh chứng hình, hình thái vẫn giống nguyên bào sợi. rõ nét nhất cho thấy tế bào trung mô trong Sau 14 ngày biệt hóa, khoáng hóa trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt đ biệt hoá chất nền chưa r , mặc dù hình thái tế bào thành tạo cốt bào. Chính những tạo cốt đ thay đổi, sau 20 ngày thấy có lắng bào này đ sinh ra mô nền tiền cốt. Mô nền đọng canxi hình thành trong chất nền khá tiền cốt này với đặc tính đặc biệt, đ tạo điển hình. Tế bào MSC không nuôi cấy lắng đọng muối khoáng (chủ yếu là canxi trong môi trường biệt hóa (nhóm chứng), và phospho), để tạo ra chất căn bản xương hình thái tế bào không có thay đổi, không sau đó. có khoáng hóa. Mức độ biểu hiện gen Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng collagen týp I (col1), osteonectin (ON), phù hợp với Nadri S (2007). TBGTM sau bone sialoprotein (BSP) so với nhóm chứng khi tách chiết từ tủy xương biệt hóa thành thấy mức độ biểu hiện gen col1 và ON tế bào tạo xương sau 3 tuần với biểu hiện không có sự khác biệt ở thời điểm 14 và hình thành nốt khoáng hóa bắt màu đỏ 20 ngày. Biểu hiện BSP có sự khác biệt ở khi nhuộm alazarin red và phân tích marker biểu hiện xương bằng kỹ thuật RT-PCR thời điểm 14 và 20 ngày sau biệt hóa. cho thấy biểu hiện dương tích osteocalcin, Tiềm năng biệt hóa xương của MSC osteopontin [2]. được xác định bằng khoáng hóa trong Tsai M.T (2012) sau nuôi cấy biệt hóa chất nền, là điều kiện duy trì trong quá TBGTM thành tạo cốt bào cũng định danh trình biệt hóa xương. Quan sát sự khoáng bằng các marker Runx2, ALP, osteocalcin. hóa sau 20 ngày biệt hóa từ MSC có Runx2 biểu hiện tăng ở ngày thứ 3 sau kiểu hình tương tự tế bào tiền thân tạo biệt hóa, ALP là marker biểu hiện sớm xương [4]. 176
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Nhiều nghiên cứu đ công bố về vai trưởng thành. ALP là một trong những trò của tế bào gốc đối với sự hồi phục protein biểu hiện sớm và điều hòa khoáng g y xương không tự hàn gắn. Vì vậy, việc hóa. nghiên cứu biệt hóa MSC thành tế bào β-catenin, Runx2 và Osx biệt hóa gốc mô xương được quan tâm nhiều. Khả thành tiền tạo cốt bào đến tạo cốt bào năng biệt hóa MSC thành dạng tạo cốt trưởng thành. Những tế bào này phẳng bào gợi mở ứng dụng liệu pháp tế bào gốc có hình con suốt. Chúng biểu hiện protein trong tái tạo mô xương. Hướng nghiên chất nền xương, BSP và OPN. cứu có ý nghĩa quan trọng giúp cung cấp Giai đoạn sau, Runx2 bị ức chế khi tạo các bằng chứng khoa học, vai trò định cốt bào trưởng thành. Osx có ở giai đoạn hướng dòng trong điều trị tái tạo xương. cuối của tạo cốt bào trưởng thành và cảm ứng biểu hiện osteocalcin. Khi tế bào Dexamethasone là một glucocorticoid hoàn tất quá trình biệt hóa có dạng hình steroid, có tác dụng kích thích biệt hóa khối và sản phẩm khoáng hóa vào chất thành xương của MSC, phụ thuộc vào nền vô cơ. Trong bào tương có bộ Golgi liều của nó, liều cao thì kích thích tạo mỡ, và lưới nội bào có hạt rất phát triển ở tạo liều thấp thì kích thích tạo xương. Liều cốt bào, kết quả là tăng các sản phẩm dùng trong nghiên cứu này phù hợp cho protein. Biểu hiện của OPN là giảm ở tạo biệt hóa tạo xương. Các yếu tố khác như cốt bào trưởng thành, trong khi biểu hiện ascorbic là yếu tố có tác dụng tham gia các protein như P2X5, alkaline phosphatase, hình thành xương như biển đổi tiền collagen týp I và osteocalcin ngày càng collagen thành collagen, glycerolphosphatase tăng [5]. có vai trò thúc đẩy hình thành chất nền KẾT LUẬN khoáng hóa. Chính vì vậy, sau một thời gian tiếp xúc với môi trường biệt hóa, các Sau khi được biệt hóa 3 tuần trong môi tế bào MSC thay đổi hình thái giống tạo trường có các chất cảm ứng tạo xương cốt bào. gồm dexamethasone và ascorbic, TBGTM tủy xương thỏ đ có dấu hiệu đặc trưng Hợp dòng và biệt hóa MSC tạo dòng của tạo cốt bào. xương được điều hòa bởi nhiều yếu tố. MSC biệt hóa tạo tiền tạo cốt bào. Tiền tạo LỜI CẢM ƠN cốt bào có hình elip, nhân nằm dọc theo Nghiên cứu thuộc phạm vi đề tài cấp tế bào và giai đoạn đầu của biệt hóa Bộ Y tế: “Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào vẫn có tiềm năng tăng sinh. Chúng tế bào gốc mô xương và khả năng ứng biểu hiện Runx2, DLx5, MSx2 và một vài dụng trong ghép tự thân trên động vật marker của tạo cốt bào như ALP, collagen thực nghiệm”. Nhóm nghiên cứu xin gửi týp I và osteopontin (OPN), nhưng biểu lời cảm ơn tới Bộ Y tế đ tài trợ cho hiện các marker yếu hơn ở tạo cốt bào nghiên cứu. 177
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO direct cell-cell contact between murine osteoblasts and mesenchymal stem cells. Int 1. Kim S.J, Jang J.D, Lee S.K. Treatment Orthop. 2012, 36 (1), pp.199-205. of long tubular bone defect of rabbit using 4. Quiroz F.G, Olga M, Estefan P et al. autologous cultured osteoblasts mixed with Isolation of human bone marrow mesenchymal fibrin. Cytotechnology. 2007, 54, pp.115-120. stem cells and evaluation of their osteogenic 2. Nadri S, Soleimani M, Hosseni R.H et al. potential. Revista Ingenierisa Biomesdica. 2008, An efficient method for isolation of murine pp.48-55 bone marrow mesenchymal stem cells. Int J 5. Zhang Y, Khan D, Delling J et al. Dev Biol. 2007, 51 (8), pp.723-729. Mechanisms underlying the osteo- and adipo- 3. Tsai M.T, Lin D.J, Huang S et al. differentiation of human mesenchymal stem Osteogenic differentiation is synergistically cells. The Scientific World Journal. 2012. influenced by osteoinductive treatment and doi:10.1100/2012/793823. 178