Biến đổi cấu trúc vi thể của mô buồng trứng chuột cống trắng sau bảo quản lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa

Nội dung text: Biến đổi cấu trúc vi thể của mô buồng trứng chuột cống trắng sau bảo quản lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC VI THỂ CỦA MÔ BUỒNG TRỨNG CHUỘT CỐNG TRẮNG SAU BẢO QUẢN LẠNH BẰNG KỸ THUẬT THỦY TINH HÓA Nguyễn Thị Hương*; Đỗ Thùy Hương* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá sự biến đổi hình thái vi thể mô buồng trứng (MBT) chuột sau bảo quản lạnh sâu và bước đầu so sánh hiệu quả bảo quản MBT chuột giữa môi trường bảo quản có EDS (etylen glycol; dimethyl sulphoxide; sucrose) và PDS (1,2 propanediol; dimethyl sulphoxide; sucrose). Đối tượng và phương pháp: chia MBT của 10 chuột thành 3 nhóm: nhóm tươi, nhóm EDS (thủy tinh hóa [TTH] có sử dụng EDS) và nhóm PDS (TTH có sử dụng PDS). Sử dụng kỹ thuật hiển vi quang học để đánh giá sự biến đổi cấu trúc mô học của nang trứng sau r đông. Kết quả: tỷ lệ nang trứng có hình thái bình thường sau bảo quản lạnh ở nhóm EDS cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm PDS, tương ứng là 35,6% và 26,6%. Tuy nhiên, không có sự khác biệt về tỷ lệ nang trứng nguyên thủy có hình thái bình thường sau bảo quản lạnh giữa ba nhóm (61,8%, 53,8% và 55,9%, p > 0,05). Kết luận: TTH MBT chuột cống trắng có thể bảo tồn được phần lớn nang trứng nguyên thủy. * Từ khóa: Mô buồng trứng chuột; Thủy tinh hóa; Biến đổi cấu trúc vi thể. Microstructural Changes of Rat Ovarian Tissue after Vitrification Summary Objectives: To assess the microstructural changes of rat ovarian tissue after vitrification and compare efficient protection of rat ovary tissue between EDS (ethylene glycol, dimethyl sulphoxide, sucrose) and PDS (1.2 propanediol, dimethyl sulphoxide, sucrose). Subjects and methods: Ovarian tissues of 10 rats were divided into 3 groups: fresh group, EDS group (vitrification using EDS) and PDS group (vitrification using EDS). Evaluation of the microstructural changes of follicles in three groups after thawing under optical microscopy. Results: The percentages of the morphologically normal follicles in the EDS group was significanty higher than that in the PDS group (35.6% vs. 26.6%, p < 0.05). However, there was no difference in the percentage of morphologically normal primordial follicleamong three groups (61.8%, 53.8% and 55.9%, p > 0.05). Conclusion: Vitrification of rat ovarian tissue could preserve majority of primordial follicle. * Keywords: Rat ovary tissue; Vitrification; Microstructural changes. ĐẶT VẤN ĐỀ phụ nữ. Chỉ định này đặc biệt phù hợp cho các bé gái và phụ nữ có nguy cơ bị Trữ lạnh MBT là một trong các phương suy buồng trứng sớm do tác dụng phụ pháp để bảo tồn chức năng sinh sản cho của hóa trị và xạ trị trong điều trị ung thư. * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Thuỳ Hương (dohuong2112@gmail.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017 205
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Phẫu thuật cấy ghép lại MBT sau bảo dimethyl sulphoxide (DMSO), sucrose), quản lạnh có thể phục hồi chức năng sinh nhóm PDS (nhóm bảo quản lạnh sâu bằng sản và nội tiết [1]. Ngày nay, trên toàn thế kỹ thuật TTH, môi trường bảo quản gồm giới đ có tới > 70 em bé được sinh ra 3 chất 1,2 propanediol (PrOH), DMSO, sau khi cấy ghép MBT [2]. sucrose) với kích thước mảnh mô 3 - 4 x Có hai kỹ thuật bảo quản MBT được 2 x 1 - 2 mm. sử dụng hiện nay: trữ lạnh theo chương - Cố định các mảnh mô của lô chứng trình và TTH. Trữ lạnh theo chương trình trong dung dịch bouin để làm tiêu bản là kỹ thuật kinh điển, được áp dụng từ nhuộm H.E (hematoxylin eosin) đánh giá rất sớm và đến nay vẫn được ghi nhận mô học. trong hiệu quả bảo tồn MBT. TTH là kỹ - Thả mảnh mô của hai nhóm còn lại thuật mới, được phát triển để trữ lạnh vào dung dịch PBS có 10% FBS chuẩn bị MBT trong khoảng một thập kỷ trở lại đây, cho quy trình bảo quản. Bảo quản mô với ưu điểm tiết kiệm thời gian, dễ thực trong nitơ lỏng trong thời gian 3 tuần, sau hiện. Nhiều nghiên cứu gần đây đánh giá đó r đông để làm tiêu bản nhuộm H.E cao hiệu quả bảo tồn MBT của kỹ thuật đánh giá mô học. này. Năm 2015, chúng tôi đ thử nghiệm * Quy trình TTH: TTH MBT thỏ. Để chuẩn hóa quy trình và - Nhóm EDS: theo phương pháp của tìm hiểu sự biến đổi của nang trứng sau Hye Won Youm (2013) [3]: bảo quản lạnh, chúng tôi tiếp tục thử nghiệm trên buồng trứng của chuột cống trắng với + Ủ mảnh mô trong môi trường E1 và mục tiêu: Đánh giá sự biến đổi hình thái E2 với nồng độ và thời gian như sau: vi thể MBT chuột sau bảo quản lạnh sâu . E1: PBS + 20% FBS + 7,5% EG + 7,5% và bước đầu so sánh hiệu quả bảo quản DMSO: 10 phút. MBT chuột giữa môi trường bảo quản có . E2: PBS + 20% FBS + 20% EG + 20% EDS và PDS. DMSO + 0,5 mol/l S: 5 phút. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP + Đặt mảnh mô vào cryotop (cọng đông NGHIÊN CỨU phôi), thả vào nitơ lỏng. 1. Đối tƣợng nghiên cứu. - Nhóm PDS: theo phương pháp của Li MBT của 10 chuột cống trắng cái thuần Yu-bin (2007) [4]: chủng khỏe mạnh, 7 - 8 tuần tuổi, trọng + Ủ mảnh mô trong môi trường P1 và lượng 100 - 130 gram. P2 với nồng độ và thời gian như sau: 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. . P1: DMEM + 10% FBS + 0,1 mol/l S + 2,0 mol/l DMSO: 5 phút. - Cắt MBT của mỗi chuột thành những miếng nhỏ, chia ngẫu nhiên vào 3 nhóm: . P2: DMEM + 10% FBS + 0,2 mol/l S + nhóm chứng, nhóm EDS (nhóm bảo quản 2,0 mol/l DMSO + 2,0 mol/l PrOH: 5 phút. lạnh sâu bằng kỹ thuật TTH, môi trường + Đặt mảnh mô vào cryotop (cọng đông bảo quản gồm 3 chất etylen glycol (EG), phôi), thả vào nitơ lỏng. 206
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Quy trình rã đông: 3 nhóm nghiên cứu theo tiêu chuẩn xếp - Nhóm EDS: loại nang trứng như sau: Lấy cryotop chứa mẫu ra khỏi bình - Nang trứng bình thường: noãn có hình chứa nitơ lỏng, thả vào PBS 370C cho tới dạng tròn đều, cân đối. Màng trong suốt có cấu trúc nguyên vẹn. Tế bào nang, khi tan đá hoàn toàn. Rửa mảnh mô bằng tế bào hạt phân bố đều đặn, khoảng cách PBS, 20% FBS với nồng độ sucrose giảm giữa các tế bào nhỏ. dần 1 mol/l, 0,5 mol/l; 0,25 mol/l; 0 mol/l. - Nang trứng bất thường: noãn méo mó, Đặt vào tủ ấm 370C, 5% CO trong 30 phút. 2 biến dạng hoặc thoái hóa, ly giải. Màng - Nhóm PDS: trong suốt không còn nguyên vẹn hoặc bị Lấy cryotop ra khỏi bình chứa nitơ ly giải. Tế bào nang, tế bào hạt sắp xếp lộn lỏng, thả vào PBS 370C cho tới khi tan đá xộn, không liên tục hoặc thoái hóa, nhân hoàn toàn. Rửa mảnh mô bằng DMEM, đông vón, tách rời khỏi bờ nang trứng. 10% FBS với nồng độ sucrose giảm dần Để tránh việc khảo sát nang trứng bị 0,5 mol/l; 0,25 mol/l; 0,125 mol/l; 0 mol/l. trùng lặp, mảnh mô được đúc block nến 0 và cắt lát dày 4 µm, cứ 16 lát lấy một lát Đặt vào tủ ấm 37 C, 5% CO2 trong 30 phút. mô để khảo sát. * Chỉ tiêu nghiên cứu: * Xử lý số liệu: bằng SPSS 16.0. Sử So sánh sự biến đổi về mặt hình thái của dụng thuật toán khi bình phương để so các loại nang trứng có trong MBT giữa sánh hai tỷ lệ. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tổng số có 738 nang trứng được khảo sát ở cả 3 nhóm nghiên cứu. Trong 4 loại nang trứng có mặt trong MBT (nang trứng nguyên thủy, nang nguyên phát, nang trứng đặc, nang trứng có hốc), nang trứng nguyên thủy chiếm tỷ lệ 27,2%; 42,5%; 30,7% tương ứng ở nhóm chứng, nhóm EDS, nhóm PDS. Nang trứng nguyên phát chiếm tỷ lệ cao nhất ở nhóm chứng, nhóm EDS, nhóm PDS tương ứng là 51,7%; 42,5%; 37,5%. 1. Số ƣợng và tỷ lệ nang trứng c h nh thái nh thƣờng. Bảng 1: Loại nang Tổng cộng Nhóm Bình thường Bất thường Số lượng % Số lượng % Chứng 125 38,2 202 61,8 327 EDS 78 35,6a 141 64,4 219 PDS 51 26,6bc 141 73,4 192 Ghi chú: a: so sánh với nhóm chứng (p > 0,05); b: so sánh với nhóm chứng (p < 0,05); c: so sánh với nhóm EDS (p < 0,05) 207
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Ở MBT tươi của chuột, 38,2% nang trứng dạng, dẫn tới tỷ lệ này bị giảm còn có hình thái bình thường. Quá trình TTH làm 53,8% và 55,9% tương ứng ở nhóm EDS và các nang trứng bị biến đổi cấu trúc dẫn tới tỷ PDS. Tuy nhiên, sự khác biệt ở cả 3 nhóm lệ này bị giảm đi. Cụ thể: nhóm EDS giảm còn không có ý nghĩa thống kê. 35,6%, tuy nhiên sự khác biệt so với mô tươi Về chất lượng của nang trứng tiến triển không có ý nghĩa thống kê. Nhóm PDS có tỷ lệ sau bảo quản: quá trình TTH làm thay đổi nang trứng bình thường thấp nhất trong 3 cấu trúc nang trứng tiến triển một cách nặng nhóm (26,6%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống nề, đặc biệt là nang trứng đặc và nang trứng kê khi so sánh giữa nhóm PDS và 2 nhóm có hốc. Không có sự khác biệt có ý nghĩa chứng và EDS. thống kê giữa nhóm EDS và nhóm chứng về 2. Số lượng và tỷ lệ nang trứng bình tỷ lệ bình thường của các nang trứng tiến thường theo giai đoạn tiến triển. triển, tuy nhiên sự khác biệt này thấy rõ khi Ở MBT tươi của chuột, 61,8% nang trứng so sánh giữa nhóm chứng và nhóm PDS. nguyên thủy có hình thái bình thường. Quá trình bảo quản lạnh và rã đông làm cho một số nang trứng nguyên thủy bị thoái hóa biến Bảng 2: Loại nang Nang nguyên thủy Nang nguyên phát Nang đặc Nang có hốc Nhóm Số nang Số bình % bình Số nang Số bình % bình Số nang Số bình % bình Số nang Số bình % bình khảo sát thường thường khảo sát thường thường khảo sát thường thường khảo sát thường thường Chứng 89 55 61,8 169 51 30,2 64 19 29,7 5 0 0 EDS 93 50 53,8a 93 24 25,8a 26 4 15,4a 7 0 0 PDS 59 33 55,9ac 72 12 16,7bc 50 5 10bc 11 0 0 Ghi chú: a: so sánh với nhóm chứng (p > 0,05); b: so sánh với nhóm chứng (p < 0,05); c: so sánh với nhóm EDS (p > 0,05) 3. Biến đổi các thành phần cấu tạo của nang trứng nguyên thủy sau bảo quản. 208
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Chất lượng noãn và tế bào nang của nang trứng nguyên thủy bị giảm không đáng kể sau quá trình TTT. Không thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh chất lượng noãn và tế bào nang ở cả 3 nhóm nghiên cứu. Bảng 3: Thành phần cấu tạo Nhóm Noãn Tế bào nang Bình thường (%) Bất thường (%) Bình thường (%) Bất thường (%) Chứng 56 (62,9) 33 (37,1) 59 (66,3) 30 (33,7) EDS 54 (58,1a) 39 (41,9a) 56 (60,2) 37 (39,8a) PDS 36 (61ab) 23 (39ab) 39 (66,1ab) 20 (33,9ab) Ghi chú: a: so sánh với nhóm chứng (p > 0,05); b: so sánh với nhóm EDS (p > 0,05) 4. Biến đổỉ các thành phần cấu tạo của nang trứng tiến triển sau bảo quản. Bảng 4: Nhóm Thành phần cấu tạo Noãn Màng trong suốt Tế bào hạt/vỏ Bình thường Bất thường Bình thường Bất thường Bình thường Bất thường (%) (%) (%) (%) (%) (%) Chứng 76 (31,9) 162 (68,1) 76 (31,9) 162 (68,1) 99 (41,6) 139 (58,4) EDS 33 (26,2a) 93 (73,8a) 34 (27a) 92 (73a) 45 (35,7a) 81 (64,3a) PDS 18 (13,5bc) 115 (86,5) 22 (16,5bc) 111 (83,5) 32 (24,1bc) 101 (75,9) Ghi chú: a: so sánh với nhóm chứng (p > 0,05); b: so sánh với nhóm chứng (p < 0,05); c: so sánh với nhóm EDS (p < 0,05) Trong 3 thành phần có mặt trong nang trứng tiến triển được khảo sát, noãn là thành phần bị biến đổi cấu trúc nhiều nhất. Mức độ tổn thương sau bảo quản của màng trong suốt có xu hướng nhẹ hơn so với noãn. Nhóm EDS có tỷ lệ noãn và màng trong suốt có hình thái bình thường tương ứng 26,2% và 27%, thấp hơn so với nhóm chứng (31,9% và 31,9%). Tuy nhiên, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Sự khác biệt thấy rõ khi so sánh giữa nhóm PDS với nhóm chứng và nhóm EDS, tỷ lệ noãn và màng trong suốt bình thường còn 13,5% và 16,5%. 209
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Tế bào hạt và tế bào vỏ là thành phần ít bị ảnh hưởng do tác động của TTH. Tỷ lệ tế bào hạt/vỏ bình thường ở nhóm EDS 35,7% so với 41,6% tỷ lệ cùng loại ở MBT tươi, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Riêng nhóm PDS tỷ lệ này giảm còn 24,1%. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm PDS với nhóm chứng và EDS. Nh m tƣơi Nhóm EDS Nhóm PDS 1 x400 2 x400 3 x400 4 x400 5 x400 6 x400 8 x400 9 x400 210
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 7 x100 8 x400 9 x400 (Ảnh 1, 2, 3: nang trứng nguyên thủy; Ảnh 4, 5, 6: nang trứng đặc; Ảnh 7, 9: nang trứng có hốc; Ảnh 8: nang trứng nguyên phát) Hình 1: Hình ảnh cấu trúc vi thể của MBT chuột trước và sau khi bảo quản lạnh. BÀN LUẬN tiến triển còn nguyên vẹn trong nguyên 1. Biến đổi cấu trúc của nang trứng cứu này thấp hơn. Chỉ một số ít các nang sau bảo quản lạnh. trứng nguyên phát và nang trứng đặc giữ được hình thái tương đối bình thường Nang trứng nguyên thủy là nang trứng sau bảo quản đông nhanh. Toàn bộ nang chưa tiến triển, là lượng nang trứng dự trữ trứng có hốc đ bị biến dạng một trong của buồng trứng. Mục tiêu của bảo quản các thành phần cấu tạo. Nhóm PDS gây lạnh MBT là bảo tồn được càng nhiều loại ảnh hưởng nặng nề nhất lên cấu trúc của nang này càng tốt. Kết quả nghiên cứu cho nang trứng tiến triến, hầu như toàn bộ thấy tỷ lệ nang trứng nguyên thủy có hình các nang trứng tiến triển đ bị biến đổi thái bình thường ở MBT tươi (61,8%). hoàn toàn. Điều này do cấu tạo của nang Sau TTH, một số nang trứng nguyên thủy trứng tiến triển có noãn là tế bào có kích bị biến dạng, thoái hóa làm tỷ lệ này giảm thước lớn, trong bào tương có những thành còn 53,8% và 55,9% tương ứng ở nhóm phần nhạy cảm với nhiệt độ như thoi vô EDS và PDS. Tuy nhiên, không thấy sự sắc đ hình thành dễ bị đứt gãy trong quá khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 3 nhóm trình đông lạnh và r đông. Vì vậy, gặp rất nghiên cứu. Với kết quả trên có thể khẳng nhiều khó khăn trong việc bảo quản nang định khả năng chịu nhiệt tốt hơn của nang trứng tiến triển. trứng nguyên thủy so với các loại nang 2. Ảnh hƣởng của nhóm TTH EDS và trứng tiến triển khác trong quá trình bảo PDS lên biến đổi hình thái của nang quản lạnh. Đặc tính này là do nang trứng trứng và các thành phần cấu tạo MBT. nguyên thủy có cấu tạo khác biệt: noãn có Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi so kích thước nhỏ, ít bào tương, trong màng sánh tổng chất lượng nang trứng bình bào tương có ít các thành phần nhạy cảm thường giữa hai nhóm EDS và PDS thấy: với nhiệt, không có màng trong suốt, ít tế nhóm EDS cho kết quả bảo quản tốt hơn bào hạt và do nang đang trong trạng thái so với nhóm PDS, đặc biệt đối với các ngủ nên tốc độ chuyển hóa chậm. nang trứng tiến triển. Tỷ lệ noãn bị thoái hóa, ly giải ở nhóm PDS cao hơn so với Khi phân tích chất lượng của nang trứng nhóm EDS. Chúng tôi cho rằng nhóm tiến triển (nang trứng nguyên phát, nang EDS bảo quản MBT chuột cống trắng tốt trứng đặc, nang trứng có hốc), sau bảo hơn nhóm PDS. EG được sử dụng phổ quản chúng tôi thấy: so với các công bố biến cho quá trình TTH vì ít gây độc tính khác trên thế giới có sử dụng phương và khả năng khuếch tán cao trong tế bào. pháp bảo quản tương tự, tỷ lệ nang trứng Thêm vào đó EG (62,07 kDa) có trọng 211
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 lượng phân tử khối nhẹ hơn DMSO (78,13 - Hỗn hợp chất bảo vệ lạnh: ethylen glycol, kDa) và PrOH (76,09 kDa), dễ dàng thấm dimethyl sulfoxide và sucrose có xu hướng vào MBT hơn. Tuy nhiên, chính vì đặc bảo tồn nang buồng trứng chuột cống trắng tính này nếu sử dụng riêng rẽ EG với tốt hơn so với kết hợp của 1,2 propanediol, nồng độ cao và thời gian dài kết quả có dimethyl sulfoxide và sucrose. thể không tốt hơn so với DMSO hoặc TÀI LIỆU THAM KHẢO PrOH. Để tận dụng tính thấm qua màng 1. Amorim C.A et al. Cryopreservation of của EG, các nghiên cứu gần đây có xu oocytes from pre-antral follicles. Hum Reprod hướng kết hợp EG với các chất bảo vệ Update. 2003, 9 (2), pp.119-129. lạnh khác: EG + GLY được chứng minh 2. Silber S et al. Ovarian tissue cryopreservation có hiệu quả trên bảo quản phôi, EG + and transplantation: scientific implications. GLY + polymer cho kết quả tốt trên MBT Journal of Assisted Reproduction and Genetics. khỉ [5], EG + DMSO + sucrose là môi 2016, 33 (12), pp.1595-1603. trường tối ưu cho MBT chuột [3], EG + DMSO + PrOH + polymer cho kết quả tốt 3. Youm H.W et al. Optimal vitrification trên MBT người [6]. protocol for mouse ovarian tissue cryopreservation: effect of cryoprotective agents and in vitro Chất bảo vệ lạnh có vai trò quyết định culture on vitrified-warmed ovarian tissue survival. thành công của quá trình TTH. MBT của Hum Reprod. 2014, 29 (4), pp.720-730. các loài động vật khác nhau phù hợp với chất bảo vệ lạnh khác nhau. Trong nghiên 4. Li Y.B et al. Modified vitrification method cứu này, chúng tôi thực hiện bảo quản for cryopreservation of human ovarian tissues. lạnh bằng kết hợp hai nhóm chất bảo vệ Chin Med J (Engl). 2007, 120 (2), pp.110-114. lạnh khác nhau với phương pháp của hai 5. Li Q et al. Ovarian function reconstruction nhóm tác giả để khảo sát tác động của by orthotopic transplantation of novel vitrification các chất bảo vệ lạnh khi kết hợp với nhau cryopreserved ovaries in chemotherapy- và tìm môi trường tối ưu cho bảo quản induced ovary damage rat model. Zhongguo MBT chuột. Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2013, 27 (9), pp.1116-1121. KẾT LUẬN 6. Ting A.Y et al. Morphological and Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi đưa functional preservation of pre-antral follicles ra một số kết luận sau: after vitrification of macaque ovarian tissue in - Thủy tinh hóa có thể bảo tồn được a closed system. Hum Reprod. 2013, 28 (5), phần lớn nang trứng nguyên thủy. pp.1267-1279. 212