Bài giảng Nguyên lý sản xuất vacxin thú y

Nội dung text: Bài giảng Nguyên lý sản xuất vacxin thú y

1.  Mỗi công đoạn đều phải mô tả chi tiết các thao tác kỹ thuật, phương pháp đánh giá sản phẩm của công đoạn. Ví dụ: phương pháp để chứng minh môi trường đó vô trùng, phương pháp tiệt trùng môi trường, điều kiện bảo quản tế bào dòng, kích thước của bình nuôi cấy, điều kiện và thời gian nuôi cấy, những quan sát của quá trình nhân lên, các chỉ tiêu và lưu ý để thu hoạch sản phẩm, kỹ thuật thu hoạch canh trùng.  Tài liệu cũng hướng dẫn cách kiểm nghiệm sản phẩm, các test kiểm tra độ tinh khiết, an toàn, hiệu lực và các yêu cầu khác của mỗi lô sản phẩm hoàn chỉnh. Những lưu ý đặc biệt khi kết thúc bao gồm quá trình đóng gói, dán nhãn, chỉ dẫn và lưu ý sử dụng, hạn sử dụng của sản phẩm.  Những hướng dẫn để sản xuất các loại vacxin thú y phải được sự phê duyệt bởi cơ quan có thẩm quyền, là tiêu chuẩn thống nhất của tất cả các lô sản xuất.
2.  Một trong những yếu tố quan trọng của quá trình sản xuất vacxin là cần phải đảm bảo an toàn sinh học trong quá trình sản xuất cũng như an toàn sinh học của nguồn nước thải, không khí khi thải ra môi trường sống xung quanh.  Để đảm bảo các yêu cầu nêu trên cơ sở sản xuất vacxin cần phải chứng minh là có đầy đủ các quy trình kỹ thuật cũng như trang thiết bị, hệ thống xử lý rác thải hữu cơ, tiệt trùng mầm bệnh như: lò hấp cao áp tiệt trùng, hố ủ vi sinh vật, đặc biệt là hệ thống xử lý nước thải.  Hệ thống xử lý nước thải, rác thải hữu cơ phải được thiết kế quy mô đồng bộ sử dụng các phương pháp sinh học, vật lý và hóa học để tiêu diệt và hạn chế mầm bệnh, độc tố trước khi thải ra môi trường.  Tất cả các thiết bị và hệ thống nói trên phải thường xuyên được kiểm tra bởi cơ quan chức năng để đánh giá mức độ tác động gây ô nhiễm môi trường.
3. 3.3. Sản xuất vacxin 3.3.1. Quá trình nhân giống và giữ giống (Master seed)  Mỗi loại vacxin được sản xuất từ một giống VSV gốc, giống VSV này qua quá trình tuyển chọn, có đủ các đặc tính sinh học đạt yêu cầu dùng để làm giống cho quá trình sản xuất vacxin, có lý lịch rõ ràng, các thông số về nguồn gốc, các chỉ số sinh học, có quy trình nhân giống và bảo quản.  Khi sản xuất giống gốc, sản xuất các mẻ đơn rồi phối hợp với nhau để tạo thành một mẻ lớn. Giống gốc được đông khô rồi bảo quản ở to thích hợp để duy trì sự sống của VSV.  Mỗi giống gốc cần được kiểm tra sự đồng nhất, an toàn và hiệu lực, độ tinh khiết cần được kiểm tra để đảm bảo giống không lẫn vi khuẩn, nấm, Mycoplasma và virus ngoại lai.  Cần chú ý rằng việc sử dụng một giống gốc và số lần cấy chuyển giới hạn sẽ giúp duy trì sự đồng nhất và tính ổn định của sản phẩm vacxin.
4. 3.3.2. Nhân giống sản xuất (working seed)  Giống sản xuất là giống dùng để tạo ra sản phẩm vacxin.  Tùy quy mô sản xuất mà phải nhân giống sản xuất tới một số lượng nào đó cho phù hợp.  Giống sản xuất được tạo ra từ giống gốc bằng cách cấy chuyển tiếp theo quy trình riêng.  Số lần cấy chuyển tiếp có thể được xác định qua dữ liệu và được thiết lập cho phù hợp trong từng trường hợp cũng nhằm duy trì sự đồng nhất và tính ổn định của vacxin.
5. 3.3. Chuẩn bị nguyên vật liệu và môi trường nuôi cấy 3.3.1. Nguyên vật liệu, hóa chất  Chi tiết và nguồn gốc của tất cả các thành phần trong sản phẩm như hóa chất, nguyên vật liệu được sử dụng trong quá trình sản xuất vacxin phải đảm bảo yêu cầu kỹ thuật và phải được phê chuẩn bởi đơn vị có thẩm quyền.  Tất cả các thành phần có nguồn gốc động vật như máu, huyết thanh mà không được tiệt trùng đều phải có kiểm tra để đảm bảo không có vi khuẩn, nấm, mycoplasma và virus ngoại lai, đồng thời phải biết được quốc gia nào cung cấp chúng.  Để tránh nhiễm khuẩn từ ngoài vào trong suốt quá trình sản xuất nên khuyến khích việc sử dụng các kỹ thuật tiệt trùng nghiêm ngặt để đảm bảo độ thuần khiết.
6.  Hạn chế sử dụng các chất bảo quản, đặc biệt là kháng sinh.  Không nên bổ sung bất kỳ loại kháng sinh nào trong quá trình sản xuất nhất là dịch nuôi cấy tế bào, các môi trường, dịch tiêm trứng.  Trong trường hợp cần thiết có thể sử dụng không quá 3 loại kháng sinh cùng một loại sản phẩm.  Những kháng sinh sử dụng trong sản xuất phải không gây ảnh hưởng cho loài vật sử dụng vacxin và không gây ô nhiễm thực phẩm có nguồn gốc từ các loài động vật sử dụng vacxin.
7. 3.3.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 3.3.2.1. Nếu là vacxin virus: Môi trường nuôi cấy thường là: a) Phôi trứng  Phôi trứng được sử dụng phổ biến để sản xuất các loại vacxin virus, đặc biệt là vacxin dùng cho gia cầm. Để nhân và giữ giống gốc người ta thường dùng trứng của các đàn gà “siêu sạch” SPF (Specific Pathogenic Free) có chứng chỉ kiểm dịch sạch 18 loại virus và các vi khuẩn như Salmonella, Mycoplasma và Mycobacterium.  Trứng dùng cho sản xuất vacxin thành phẩm có thể dùng các đàn gà sạch nuôi trong các trại gà tập trung có theo dõi dịch bệnh và phải được kiểm tra sạch với một số mầm bệnh đặc biệt là H5N1, Newcastle, Mycoplasma, Salmonella và không được tiêm vacxin.  Đường tiêm trứng cũng như loại chất thu hoạch tùy thuộc vào đặc tính thích nghi của từng loại vi sinh vật đã được cấy chuyển.
8. b) Môi trường nuôi cấy tế bào  Với các vacxin được sản xuất bằng nuôi cấy tế bào cần chuẩn bị một nguồn tế bào MCS (Master Cell Stock) phù hợp và ổn định. Mỗi nguồn tế bào cần đảm bảo tính đồng nhất và đặc tính di truyền trong giới hạn số lần cấy chuyển đồng thời phải tinh khiết, không được lẫn vi khuẩn, nấm, mycoplasma và virus ngoại lai.  Môi trường tế bào được sử dụng trong sản xuất vacxin thường là các tế bào nguyên thủy (primary cell) có nguồn gốc từ những mô thông thường bao gồm cả những tế bào sau khi cấy chuyển nhiều lần. Các vacxin sử dụng cho gia cầm thường được sản xuất từ nguồn nuôi tế bào xơ phôi gà sạch bệnh; Một số loại vacxin được sản xuất từ nguồn nuôi tế bào nguyên thủy có nguồn gốc từ các phôi thông thường của động vật khỏe mạnh.  Mỗi loại tế bào đều có một quy trình chi tiết chỉ dẫn kỹ thuật nuôi cấy cho đến bước cuối cùng là thu hoạch vacxin.
9.  3.3.2.2. Vacxin vi khuẩn  Cần chuẩn bị các môi trường thích hợp để nhân giống sản xuất và môi trường sản xuất vacxin.  Tùy theo quy mô mà chuẩn bị lượng môi trường, nhiều ít khác nhau.  Dù là vacxin vi khuẩn nhược độc hay vô hoạt, bước đầu người ta đều cấy giống sản xuất vào môi trường sản xuất vacxin và nuôi ở 370C trong các bình nuôi cấy hoặc các thiết bị lên men sục khí.  Ví dụ: Môi trường sản xuất thường dùng với vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt: Hottinger 50% Nước dạ dày lợn 50% Pepton bột 10% Glucoza 0,2% NaCl 0,9%
10. 3.3. Vệ sinh khu vực sản xuất 3.3.1. Mục đích  Đảm bảo yêu cầu vô trùng về nhà xưởng, trang thiết bị trong khu vực sản xuất trước và sau khi sản xuất, đặc biệt là phòng vô trùng, nơi thực hiện những thao tác kỹ thuật chính trong nuôi cấy, san, chia môi trường và chế phẩm. 3.3.2. Thực hiện ❖ Trước khi làm việc 1 ngày cần tiến hành: 0  Lau hốt bằng gạc vô trùng có tẩm cồn 70  Hút bụi, lau sàn nhà 2 lần, lần 1 bằng nước cất, lần 2 bằng dung dịch sát trùng thích hợp (ví dụ Vetvaco-Iodine 10%).  Bật máy hút ẩm.  Bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi vào phòng làm việc.  Kiểm tra vô trùng bằng phương pháp đặt đĩa thạch.
11. ❖ Sau khi làm việc 0  Lau hốt bằng gạc vô trùng có tẩm cồn 70  Lau các dụng thường dùng (dao, kéo, pank, kẹp ) và bàn làm việc bằng gạc tẩm cồn 700  Hút bụi sàn nhà, lau sàn 2 lần.  Hút ẩm  Bật đèn tử ngoại ❖ Một tuần tổng vệ sinh toàn bộ nhà xưởng như hút bụi, lau sàn, d c thường dùng và bàn làm việc, cửa kính ❖ Xông phòng hàng quý hoặc trước khi vào đợt sản xuất mới.
12.  Sau khi tổng vệ sinh toàn bộ khu vực sản xuất, dùng formaldehyte 40% để khử trùng. 3  Liều lượng: 35 ml formaldehyte+17,5g KMnO4/m k.khí, thời gian xông 24 giờ. 3  Trung hòa bằng Amonihydroxyt 0,5 ml/m không khí. ❖ Kiểm tra vô trùng bằng phương pháp đặt đĩa thạch.
13. MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACXIN
14. Số lượng tăng sinh Pha (VK/ml) cân bằng Pha tử Pha logarit vong Pha tiềm tàng Thời gian (h) ĐỒ THỊ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY KÍN
15. 1. Quy trình sản xuất vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt (Swine Salmonella vaccine) Giống gốc gồm các chủng S1, S2 Kiểm tra thuần khiết Môi trường nhân giống Kiểm tra thuần khiết Tập trung giống sản xuất 10 lít Cấy giống vacxin Kiểm tra thuần khiết 370C/sau 8h Lên men sục khí 370C/24h tiệt trùng bằng formol 0,8%) Đếm số (10 tỷ vi khuẩn/1ml) Lắc giải độc ở 370C/7 ngày Kiểm tra vô trùng Kiểm tra an toàn độc tố Pha loãng tới nồng độ 10 tỷ vi khuẩn/ml Kiểm tra bán Bổ sung nước phèn 10% thành phẩm Lọ nước thịt 50ml Kiểm tra thành phẩm Ra chai → dán nhãn → bảo quản 2 -100C Vật lý, an toàn, vô trùng, hiệu lực
16. 2. Quy trình sản xuất vacxin nhiệt thán (Anthrax spore vaccine)  Vacxin nhiệt thán được chế tạo từ nha bào của vi khuẩn nhiệt thán vô độc không có giáp mô (Avirulenous B. anthracis strain)  Vacxin được sản xuất từ 2 thể:  Thể đông khô  Thể lỏng trong dung dịch glyxerin, mỗi ml vacxin chứa khoảng 30 triệu nha bào.
17. Quy trình sản xuất vacxin nhiệt thán Giống gốc Giống sản xuất Kiểm tra thuần khiết Martine 370C/24h Cấy giống sản xuất vacxin Kiểm tra mức độ hình thành nha 370C/7-10 ngày bào ( 90% thì thu hoạch Tập trung thành phẩm Bổ sung Glycerin 30% 15 lít Kiểm nghiệm Ra chai → dán nhãn → bảo quản 2 -100C/2 năm Kiểm nghiệm Đông khô → dán nhãn → bảoquản
18. VACXIN VIRUS NHƯỢC ĐỘC CHẾ TRÊN PHÔI TRỨNG Giống gốc -1 Pha với nước sinh lý nồng độ 10 hoặc xELD50) Kiểm tra vô trùng Gây giống sản xuất Gây nhiễm phôi trứng Ấp tiếp ở 370C/x 36 giờ Thu trứng, để lạnh 40C/12h Mổ trứng Thu chất chứa virus Kiểm tra vô trùng Bán thành phẩm chuẩn độ hiệu giá Kiểm nghiệm vacxin Ra chai → dán nhãn → bảo quản 2 -100C/2 năm Ra chai → Đông khô → dán nhãn → bảoquản
19. Hình : Đường biểu diễn quy luật hình thành kháng thể khi dùng vacxin ở động vật Hàm lượng kháng thể Ngưỡng bảo hộ Thời điểm tác động 7 ngày 21 ngày Thời gian miễn dịch
20. Hình: Đường biểu diễn phản ứng miễn dịch khi tiêm vacxin nhắc nhở Hàm lượng kháng thể Ngưỡng bảo hộ Thời điểm tác động Sơ chủng Nhắc nhở Thời gian miễn dịch
21. Hình: Đường biểu diễn phản ứng miễn dịch khi tái chủng Hàm lượng kháng thể Ngưỡng bảo hộ Thời điểm Thời điểm tái chủng Thời gian miễn dịch tác động