Ảnh hưởng của carbonyl - cyanide m-chlorophenylhydrazone lên chức năng ty thể của tế bào cơ tim chuột H9C2

Nội dung text: Ảnh hưởng của carbonyl - cyanide m-chlorophenylhydrazone lên chức năng ty thể của tế bào cơ tim chuột H9C2

1. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 27-32 Ảnh hưởng của carbonyl-cyanide m-chlorophenylhydrazone lên chức năng ty thể của tế bào cơ tim chuột H9C2 Ngô Thị Hải Yến, Bùi Thị Vân Khánh, Vũ Thảo Hiền, Tô Thanh Thúy, Phạm Thị Bích, Đặng Thị Hà Trang, Vũ Thị Thu* Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 19 tháng 10 năm 2017 Chỉnh sửa ngày 14 tháng 11 năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 06 tháng 12 năm 2017 Tóm tắt: Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của carbonyl-cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) tới chức năng ty thể của tế bào cơ tim chuột H9C2. Thành phần lipid màng ty thể (cardiolipin) và điện thế màng ty thể được phân tích thông qua sự thay đổi mật độ huỳnh quang của tetramethyl rhodamine ethyl ester (TMRE) và 10-nonyl acridine orange (NAO) sử dụng kính hiển vi đồng tiêu LSM800. Kết quả thu được cho thấy CCCP tác động mạnh và đồng thời đến mật độ và chức năng ty thể của tế bào H9C2. Từ khóa: Ty thể, H9C2, điện thế màng. 1. Đặt vấn đề minh hoạt tính sinh học mới của chất hay thuốc thường có sử dụng các chất ức chế hay chất kích Bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong thích với các tính năng đã biết [10]. Trong đó, phổ biến nhất trên toàn thế giới [1]. Những tổn carbonyl-cyanide m-chlorophenylhydrazone thương trong bệnh lý tim mạch có liên quan (CCCP) thường được sử dụng như một chất ức nhiều đến sự thay đổi cấu trúc và chức năng ty chế chuỗi hô hấp màng ty thể do nó liên quan thể [2-5]. Thực tế, nhiều nghiên cứu đã tập đến việc vận chuyển ion H+ (protonphore), qua trung phân tích sự thay đổi cấu trúc và chức đó làm giảm làm điện thế màng của bào quan năng của bào quan này [6-8], như khả năng này [10-12]. CCCP có cơ chế tác động sinh học tổng hợp năng lượng ATP, giá trị điện thế lớp phụ thuộc vào nồng độ. Ngoài đích tác động là màng ty thể hay hoạt động của chuỗi hô hấp ty chuỗi hô hấp điện tử ở màng ty thể, ở nồng độ thể. Tế bào H9C2 là một dòng tế bào có nguồn cao CCCP cũng có thể làm giảm điện thế màng gốc từ mô cơ tim phôi thai chuột BDX1 và tế bào H9C2 [13]. Hơn nữa, CCCP cũng có khả thường được sử dụng trong các mô hình nghiên ức chế lượng ion Ca2+ tích tụ trong ty thể trong cứu bệnh về tim mạch như thiếu máu cục bộ cơ mô hình bệnh lý tim [11, 13]. tim, phì đại cơ tim, nghiên cứu sàng lọc và tạo Tuy nhiên, các nghiên cứu về ảnh hưởng thuốc mới [9]. của CCCP lên ty thể tế bào H9C2 còn chưa Để củng cố phương pháp cũng như khẳng nhiều. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến định kết quả, các nghiên cứu sàng lọc hay chứng hành nghiên cứu khảo sát tác động của CCCP ở _______ một số liều nồng độ lên cấu trúc và chức năng Tác giả liên hệ. ĐT.: 84-903237808. màng ty thể thông qua phân tích thay đổi mật Email: vtthu2015@gmail.com độ huỳnh quang theo thời gian của các chỉ thị 2 7
2. 28 N.T.H. Yến và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 27-32 thành phần lipid cấu trúc màng trong ty thể 2.4. Phân tích các thông số chức năng ty thể (cardiolipin) và giá trị điện thế màng trong ty Sau 48 giờ nuôi cấy trên đĩa nuôi đáy kính thể (ΔΨm). trong , tế bào H9C2 được nhuộm NAO (0,1µM, Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng CCCP có ex/em:495/519nm), TMRE (0,1µM, tác động làm biến đổi đồng thời cả cấu trúc và ex/em:530/580nm) trong 20 phút và ở nhiệt độ chức năng ty thể tế bào H9C2 thông qua việc phòng. Sau đó, các mẫu thí nghiệm được rửa 3 giảm tín hiệu huỳnh quang chỉ thị thành phần lần bằng PBS [14]. Mật độ huỳnh quang của lipid cardiolipin (10-N-nonyl acridine orange, TMRE và NAO được xác định bằng kính hiển NAO) và điện thế màng ty thể (Tetramethyl vi đồng tiêu LSM800 (Carl Zeiss, Jena, rhodamine, ethyl ester, TMRE). Kết quả này sẽ Germany) với vật kính 20x và 63x. Ảnh được là tiền đề hỗ trợ cho các phân tích hướng đích phân tích bằng phần mềm Zen (Carl Zeiss, ty thể trong các mô hình nghiên cứu tim mạch Jena, Germany). Sự thay đổi mật độ huỳnh sử dụng tế bào H9C2. quang TMRE và NAO của tế bào H9C2 khi chúng được bổ sung CCCP (1µM và 2µM trong 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 20 phút cũng được theo dõi bằng hệ thống LSM800 (20x) tại 10 vùng khác nhau trên đĩa 2.1. Đối tượng confocal và ảnh phân tích bằng phần mềm Zen Tế bào cơ tim chuột H9C2 (ATCC® CRL- (Carl Zeiss, Jena, Germany). 1446™). 2.5. Xử lý số liệu 2.2. Hóa chất và thiết bị Kết quả nghiên cứu được phân tích sử dụng phần mềm Zen và Excel 2016. p<0.05 phản ánh Môi trường Dulbecco's Modified Eagle sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Medium (DMEM, Lonza), Photphate buffered saline (PBS, Lonza), Fetal bovine serum (FBS, 3. Kết quả và bàn luận Lonza); chất nhuộm chỉ thị điện thế màng ty thể Tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE, 3.1. Thành phần lipid màng ty thể và điện thế Invitrogen); chất nhuộm chỉ thị cardiolipin màng ty thể tế bào H9C2 màng ty thể 10-N-nonyl acridine orange (NAO, Thành phần lipid (cardiolipin) màng trong Invitrogen, USA); Dimethyl Sulfoxide (DMSO, ty thể và điện thế màng ty thể được theo dõi bởi Sigma), Carbonyl cyanide-4-phenylhydrazon huỳnh quang của NAO và TMRE như đã mô tả (CCCP); đĩa nuôi cấy confocal (SPL Life trong các nghiên cứu trước đây [12, 15, 16]. Sự Sciences, Korea); hệ thống kính hiển vi đồng tích tụ NAO và TMRE trong ty thể tế bào tiêu (Confocal microscopy, LSM800 của Carl H9C2 được thể hiện trong Hình 1. Zeiss) và các thiết bị vật tư tiêu hao phục vụ thí nghiệm khác. 2.3. Nuôi cấy tế bào cơ tim chuột (H9C2) Tế bào cơ tim chuột H9C2 được nuôi cấy ổn định trong môi trường DMEM (Lonza Walkersville, MD, USA) có bổ sung 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và 1% Penicillin- Streptomycin (PS; ThermoFisher Scientific A B 0 Inc.) ở điều kiện 37 C và CO2 5% trong đĩa B confocal đáy kính trong. Sau 48 tiếng các tế bào Hình 1. Mật độ huỳnh quang của NAO và TMRE trong tế bào H9C2. sẽ được bổ sung thêm TMRE, NAO và được xử lý với CCCP 1µM và 2µM.
3. N.T.H. Yến và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 27-32 29 A- Thành phần lipid màng trong ty thể được ảnh hưởng tới thành phần cấu trúc hoạt động nhuộm bởi NAO; B- Điện thế màng ty thể được của cardiopilin [17]. Lượng cardiolipin màng nhuộm bởi TMRE. Hình ảnh tế bào được chụp trong ty thể biến đổi dẫn đến lượng NAO tích tụ với vật kính 63x, thước đo 5µm. trong ty thể cũng giảm dần. Kết quả từ Hình 1 cho thấy, mật độ huỳnh Ảnh hưởng của CCCP tới thành phần lipid quang màu xanh của NAO (Hình 1A) và màu màng trong ty thể tế bào H9C2 phụ thuộc vào đỏ của TMRE (Hình 1B) trong tế bào H9C2 thời gian và nồng độ. Giá trị % mật độ huỳnh sáng đậm và rõ nét. Điều này thể hiện hàm quang của NAO khi tế bào được bổ sung thêm lượng cardiolipin lớn hay số lượng ty thể trong CCCP giảm dần trong thời gian 20 phút (Hình tế bào nhiều đồng thời ghi nhận điện thế hoạt 2A). Sự giảm mật độ huỳnh quang NAO của động của màng ty thể ở trạng thái sinh lý bình H9C2 khi xử lý tế bào với CCCP ở nồng độ thường của tế bào H9C2. 2µM mạnh hơn so với khi xử lý tế bào với CCCP ở nồng độ 1µM (Hình 2B). Điểm khác 3.2. Ảnh hưởng của carbonyl-cyanide biệt này ở các thời điểm 5 phút, 10 phút, 15 m-chlorophenylhydrazone lên thành phần lipid phút và 20 phút đều có ý nghĩa thống kê màng trong ty thể (p<0,05). Đặc biệt, giá trị % mật độ huỳnh Kết quả Hình 2 cho thấy CCCP làm giảm quang NAO giảm mạnh ghi tại thời điểm 5 phút giá trị % mật độ NAO trong ty thể tế bào H9C2 đầu tiên với 70,83±10,86 và 35,69±4,04 lần (so với thời điểm tế bào chưa được bổ sung lượt ở các nồng độ CCCP tương ứng là 1µM và CCCP). Điều này có thể giải thích do CCCP có 2µM. Sau đó, giá trị % mật độ huỳnh quang này tác động đến cardiolipin ở màng trong ty thể. giảm chậm hơn và tại thời điểm 20 phút còn CCCP phá vỡ gradient H+ bằng cách cho H+ 54,51±11,52 và 24,13±3,06 (p<0.05 so với thời chuyển động tự do qua màng trong ty thể, vì điểm tế bào chưa được xử lý thuốc). vậy làm giảm pH chất nền ty thể và đồng thời CCCP 1µM CCCP 2µM 0 phút 5 phút 20 phút A B Hình 2. Ảnh hưởng của CCCP lên thành phần lipid màng ty thể của tế bào H9C2. A- Ảnh đại diện cho sự thay đổi mật độ huỳnh quang của NAO dưới tác động của CCCP 1µM, 2µM tại các thời điểm 0 phút (chưa thử thuốc), 5 phút và 20 phút. Hình ảnh được chụp với vật kính 63x, thước đo 20µm. B- Biểu đồ thể hiện sự thay đổi mật độ huỳnh quang của NAO dưới tác động của CCCP 1µM, 2µM trong 20 phút. Điểm khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0,05, *so với thời điểm chưa có thuốc, # so với CCCP 1µM.
4. 30 N.T.H. Yến và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 27-32 3.3. Ảnh hưởng của carbonyl-cyanide gây tổn thương ty thể và gây chết tế bào [18]. m-chlorophenylhydrazone lên điện thế màng Tương tự với những kết quả ghi nhận được khi ty thể theo dõi mật độ huỳnh quang NAO, giá trị TMRE cũng thay đổi theo nồng độ và thời gian Điện thế màng ty thể là tham số quan trọng thử CCCP, kết quả này là khá tương đồng với để đánh giá chức năng của ty thể. Sự sụt giảm các nghiên cứu trước đây [10, 12, 13]. điện thế màng do nhiều nguyên nhân, có thể f CCCP 1µM CCCP 2µM 0 phút 5 phút 20 phút A B Hình 3. Ảnh hưởng của CCCP lên điện thế màng ty thể của tế bào H9C2. A- Ảnh đại diện cho sự thay đổi mật độ huỳnh quang TMRE dưới tác động của CCCP ở nồng độ 1µM, 2µM tại các thời điểm 0 phút (chưa thử thuốc), 5 phút và 20 phút. Ảnh được chụp dưới vật kính 63x, thước đo 20µm. B- Biểu đồ thể hiện sự thay đổi mật độ huỳnh quang của TMRE dưới tác dụng của CCCP ở nồng độ 1µM và 2µM trong 20 phút. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0,05, *so với thời điểm chưa xử lý CCCP, # so với CCCP 1µM. Điện thế màng ty thể của tế bào H9C2 52,46±13,24% (CCCP 1µM) và 18,91±6,77 giảm dần theo thời gian dưới tác động của % (CCCP 2µM) (Hình 3A, 3B). CCCP thể hiện ở sự giảm giá trị % mật độ Kết quả Hình 3 còn cho thấy ở nồng độ huỳnh quang của TMRE so với thời điểm 2µM, CCCP gây ức chế mạnh điện thế màng ty chưa thử thuốc (Hình 3). Tác động khử cực thể hơn so với CCCP ở nồng độ 1µM. Sự khác màng ty thể của CCCP này phụ thuộc vào biệt có ý nghĩa thống kê (Hình 3B, p<0,05). nồng độ, và điều này cũng được khẳng định Bên cạnh đó, theo dõi sự giảm điện thế trong nghiên cứu đã được công bố trước [13]. màng trên Hình 3A, chúng tôi thấy một số tế Hình ảnh mật độ huỳnh quang TMRE (màu bào H9C2 được bổ sung CCCP 2µM có giá trị đỏ) giảm mạnh nhất trong 5 phút đầu tiên sau điện thế cao hơn ngưỡng bình thường thể hiện khi xử lý CCCP ở cả hai nồng độ 1µM và thông qua sự xuất hiện các điểm sáng màu đỏ 2µM. Giá trị % TMRE ở thời điểm 5 phút lần với cường độ mạnh và không giảm nhiều trong lượt là 67,3±10,96 và 44,46±11,01 lần lượt ở 20 phút. Tuy nhiên, cơ chế phát sinh hiện tượng các nồng độ CCCP tương ứng là 1µM và này cần được nghiên cứu chi tiết hơn trong các 2µM. Sự thay đổi giá trị độ huỳnh quang này nghiên cứu tiếp theo. tiếp tục được ghi nhận tại thời điểm 20 phút sau thử thuốc, với giá trị tương ứng là
5. N.T.H. Yến và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 27-32 31 4. Kết luận myocardial ischemia/reperfusion injury. Int J Cardiol, 2013. 168(3): p. 2851-9. Nghiên cứu này lần đầu cung cấp số liệu về [9] Thu, V.T., et al., NecroX-5 exerts anti- ảnh hưởng của CCCP lên thành phần cấu trúc inflammatory and anti-fibrotic effects via và chức năng ty thể của tế bào H9C2 theo thời modulation of the TNFα/Dcn/TGFβ1/Smad2 pathway in hypoxia/reoxygenation-treated rat gian và theo nồng độ thuốcthử dựa vào kỹ thuật hearts. The Korean Journal of Physiology & hình ảnh hiển vi huỳnh quang. CCCP ở nồng độ Pharmacology : Official Journal of the Korean 2µM có tác động tới ty thể nhanh và mạnh hơn Physiological Society and the Korean Society of so với CCCP ở nồng độ 1µM. Chúng tôi hi Pharmacology, 2016. 20(3): p. 305-314. vọng, kết quả này sẽ là cơ sở tiền đề cho các [10] Thu, V.T., et al., Glutathione peroxidase 1 nghiên cứu ty thể của tế bào H9C2 protects mitochondria against tiếp theo. hypoxia/reoxygenation damage in mouse hearts. Pflugers Arch, 2010. 460(1): p. 55-68. [11] Kasianowicz, J., R. Benz, and S. McLaughlin, The Lời cảm ơn kinetic mechanism by which CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) transports Chúng tôi chân thành cảm ơn quỹ nghiên protons across membranes. J Membr Biol, 1984. cứu Nafosted 106-YS.06-2016.23 đã hỗ trợ 82(2): p. 179-90. chúng tôi thực hiện nghiên cứu này. [12] Jeong, S.H., et al., Echinochrome a increases mitochondrial mass and function by modulating mitochondrial biogenesis regulatory genes. Mar Drugs, 2014. 12(8): p. 4602-15. Tài liệu tham khảo [13] Zholobenko, A.V., et al., On the causes and consequences of the uncoupler-like effects of [1] HeronM, et al., Deaths: Final Data for 2006, in quercetin and dehydrosilybin in H9c2 cells. PLoS National Vital Statistics Reports. 2009. p. 1-134. ONE, 2017. 12(10): p. e0185691. [2] Carden, D.L. and D.N. Granger, Pathophysiology [14] Thu, V.T., et al., NecroX-5 protects mitochondrial of ischaemia-reperfusion injury. J Pathol, 2000. oxidative phosphorylation capacity and preserves 190(3): p. 255-66. PGC1alpha expression levels during [3] Boudina, S., et al., Alteration of mitochondrial hypoxia/reoxygenation injury. Korean J Physiol function in a model of chronic ischemia in vivo in Pharmacol, 2016. 20(2): p. 201-11. rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002. [15] Chanoit, G., et al., Inhibition of 282(3): p. H821-31. phosphodiesterases leads to prevention of the [4] Solaini, G. and D.A. Harris, Biochemical mitochondrial permeability transition pore dysfunction in heart mitochondria exposed to opening and reperfusion injury in cardiac H9c2 ischaemia and reperfusion. Biochem J, 2005. cells. Cardiovasc Drugs Ther, 2011. 25(4): p. 299- 390(Pt 2): p. 377-94. 306. [5] Thu, V.T. and L.T.L. Kim Hyoung Kyu, Tô [16] Tanno, M., et al., Translocation of glycogen Thanh Thúy, Bayalagmaa Nyamaa, Phạm Thị synthase kinase-3beta (GSK-3beta), a trigger of Bích, Nari Kim, Han Jin, Curcuminoids ức chế sự permeability transition, is kinase activity- phát triển của tế bào ung thư tủy KMS-20 bằng dependent and mediated by interaction with cách làm thay đổi chức năng ty thể. Tạp chí Sinh voltage-dependent anion channel 2 (VDAC2). J lý học Việt Nam, 2016. Biol Chem, 2014. 289(42): p. 29285-96. [6] Perry, S.W., et al., Mitochondrial membrane [17] Gohil, V.M., et al., Cardiolipin biosynthesis and potential probes and the proton gradient: a mitochondrial respiratory chain function are practical usage guide. Biotechniques, 2011. 50(2): interdependent. J Biol Chem, 2004. 279(41): p. p. 98-115. 42612-8. [7] Kim, T., et al., Does strong hypertrophic condition [18] Lemasters, J.J., et al., Role of mitochondrial inner induce fast mitochondrial DNA mutation of rabbit membrane permeabilization in necrotic cell death, heart? Mitochondrion, 2008. 8(3): p. 279-83. apoptosis, and autophagy. Antioxid Redox Signal, 2002. 4(5): p. 769-81. [8] Han, J., et al., Effects of the novel angiotensin II receptor type I antagonist, fimasartan on
6. 32 N.T.H. Yến và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 2 (2017) 27-32 Effects of Carbonyl-cyanide m-chlorophenylhydrazone on Mitochondrial Function of H9C2 Cells Ngo Thi Hai Yen, Bui Thi Van Khanh, Vu Thao Hien, To Thanh Thuy, Pham Thi Bich, Dang Thi Ha Trang, Vu Thi Thu Faculty of Biology, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam Abstract: We examined the effects of carbonyl-cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) on mitochondrial function of H9C2 cells. Composition of mitochondrial membrane lipids (cardiolipin) and mitochondrial membrane potential was analyzed by fluorescence intensity change of tetramethyl rhodamine ethyl ester (TMRE) and 10-nonyl acridine orange (NAO) using the LSM800 confocal microscope. Our results showed that CCCP simultaneously affected mitochondrial structure and function of H9C2 cells. Keywords: Mitochondria, H9C2, membrane potential.